Verschil tussen PCR en RT PCR

Belangrijkste verschil - PCR versus RT-PCR

PCR en RT-PCR zijn twee belangrijke technieken in de moleculaire biologie. PCR werd ontwikkeld door Kary Mullis in de jaren tachtig. Het is in staat om het aantal kopieën van een bepaald gen op een exponentiële manier te verhogen, hetgeen de detectie van dat specifieke DNA-fragment vergemakkelijkt. Taq Polymerase is het enzym dat het meest wordt gebruikt in PCR-systemen. Het is een thermostabiel enzym. In RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR. Het enzym reverse transcriptase is betrokken bij de synthese van complementair DNA uit RNA. De grootste verschil tussen PCR en RT-PCR is dat PCR gebruikt dubbelstrengig DNA als de matrijs terwijl RT-PCR RNA als de matrijs gebruikt.

Key Areas Covered

1. Wat is PCR
      - Definitie, proces, toepassing
2. Wat is RT PCR
      - Definitie, kenmerken, toepassing
3. Wat is het verschil tussen PCR en RT PCR
      - Vergelijking van belangrijke verschillen

Belangrijkste termen: PCR, RT-PCR, polymerasekettingreactie, reverse transcriptie-polymerasekettingreactie, DNA-sjabloon, DNA-polymerase, denaturatie, gloeien, primerverlenging

Wat is PCR

PCR (Polymerasekettingreactie) is een relatief eenvoudige maar revolutionaire methode. PCR gebruikt het vermogen van het enzym DNA-polymerase om nieuwe strengen DNA op een complementaire manier te synthetiseren met de aangeboden matrijsstreng. PCR is een onmisbare techniek die wordt gebruikt in zowel klinische als onderzoekslaboratoria voor functionele analyse van genen, diagnose en bewaking van erfelijke ziekten, DNA-klonering, sequencing en oude DNA-amplificatie. DNA-matrijs, nucleotiden, primers en DNA-polymerase zijn de vier belangrijkste componenten van PCR. De DNA-sjabloon is meestal een dubbelstrengig DNA met de doelsequentie, die moet worden geamplificeerd. Taq DNA-polymerase waarvan geïsoleerd is Thermus watersporten wordt veel gebruikt in PCR. De pfu DNA-polymerase is een ander type DNA-polymerase met high fidelity. Beide Taq en pfu polymerasen zijn hittebestendig. De nucleotiden die worden toegevoegd door de DNA-polymerasen zijn adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T). Omdat DNA-polymerase alleen een nieuw nucleotide in een 3'-uiteinde van een reeds bestaande DNA-streng kan toevoegen, is een oligonucleotide-primer vereist voor de initiatie van DNA-synthese. De vereiste van een primer bij PCR maakt het mogelijk om alleen een specifiek gebied in de sjabloon af te bakenen. De doelsequentie wordt geflankeerd door voorwaartse en achterwaartse primers. Aan het einde van een PCR worden nieuwe kopieën, amplicons van een specifieke DNA-sequentie genoemd, in miljarden geaccumuleerd. De componenten van de PCR moeten op een dergelijke manier worden geoptimaliseerd om de PCR-prestaties te verbeteren terwijl het falen tot een minimum wordt beperkt.

PCR is een geautomatiseerd proces dat wordt uitgevoerd door thermische cyclers, die in staat zijn om te schakelen tussen verschillende temperaturen. PCR is een proces in drie stappen.

1. Denaturation - De dubbelstrengige DNA-matrijs wordt gescheiden in twee enkele strengen door verwarming tot 94-95 ° C.
2. gloeien - De voorwaartse en achterwaartse primers binden aan de complementaire sequenties in de matrijs. De temperatuur van deze stap hangt af van de smelttemperatuur van de primercombinatie.
3. Primerverlenging - DNA-polymerase-enzym verlengt elk van de primers aan hun 3'-uiteinde door complementaire basen aan de groeiende streng toe te voegen. De optimale temperatuur van Taq polymerase, 72 ° C wordt gebruikt als de temperatuur in de extensiestap. De tijd van de uitbreiding hangt af van het aantal baseparen in de sjabloonstreng.         

De drie stappen worden 28-35 keer herhaald.

Figuur 1: Polymerase kettingreactie

De producten van de PCR worden op grootte gefractioneerd door agarosegelelektroforese in vergelijking met een DNA-ladder. De visualisatie van DNA op een agarosegel wordt gedaan door kleuring met ethidiumbromide en waar te nemen onder UV. De geamplificeerde DNA-banden onder UV in een ethidiumbromide-gekleurde gel worden getoond in Figuur 2. DNA-ladder wordt getoond in de meest linkse put.

Figuur 2: DNA-banden

Wat is RT-PCR

RT-PCR (Reverse transcriptie-polymerasekettingreactie) is een van de meest gevoelige technieken die worden gebruikt voor de detectie van mRNA. RNA is het geschikte sjabloon voor het verzamelen van informatie over de genexpressie van een normaal weefsel of de genexpressie van een geïnfecteerd weefsel. De matrijs voor de RT-PCR kan respectievelijk totaal RNA of viraal of bacterieel RNA zijn. RNA wordt reverse getranscribeerd in complementair DNA (cDNA) door het enzym reverse transcriptase. De optimale temperatuur van reverse transcriptase is 46 ° C. Het cDNA wordt gebruikt in PCR om het product te verkrijgen. Stappen in de omgekeerde transcriptie PCR worden getoond in figuur 3.

Figuur 3: RT-PCR

RT-PCR kan worden uitgevoerd in een tweestaps- of eenstapsreactie. In de tweestapsreactie worden de reverse transcriptie en PCR in twee afzonderlijke stappen uitgevoerd. In eenstaps RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR in een enkele buis op een sequentiële manier. Zowel cDNA als uiteindelijk PCR-product kan op een agarosegel worden uitgevoerd voor de groottefractionering en visualisatiedoeleinden. Eenstaps en tweestaps RT-PCR worden getoond in figuur 4.

Figuur 4: Eén-stap en tweestaps RT-PCR

Verschil tussen PCR en RT-PCR

Definitie

PCR: PCR is een techniek die in de moleculaire biologie wordt gebruikt om een ​​DNA-segment te amplificeren dat miljoenen kopieën van een DNA-sequentie genereert.

RT-PCR: RT-PCR is een variant van PCR die wordt gebruikt bij de detectie van genexpressie in de moleculaire biologie.

Stappen

PCR: Denaturatie, annealing en extensie zijn de drie stappen in PCR.

RT-PCR: In RT-PCR wordt reverse transcriptie gevolgd door PCR. 

Sjabloon

PCR: Een dubbelstrengs DNA-molecuul dient als de matrijs voor PCR.

RT-PCR: Een enkelstrengig RNA-molecuul dient als de matrijs voor de reverse transcriptie. Een enkelstrengig DNA-molecuul dient als de matrijs voor de PCR.

Enzymen gebruikt

PCR: DNA-polymerase wordt gebruikt als het enzym in PCR.

RT-PCR: Reverse transcriptase en DNA-polymerase worden gebruikt als enzymen in RT-PCR.

primers

PCR: Voorwaartse en achterwaartse primers worden gebruikt in de PCR.

RT-PCR: Alleen de reverse primer wordt gebruikt voor de reverse transcriptie en zowel voorwaartse als reverse primers worden in de PCR gebruikt.

Gevoeligheid

PCR: PCR is een gevoelige methode.

RT-PCR: RT-PCR is gevoeliger dan PCR.

toepassingen

PCR: PCR wordt gebruikt in functionele analyse van genen, diagnose en monitoring van erfelijke ziekten, DNA-klonen, DNA-sequencing en oude DNA-amplificatie.

RT-PCR: RT-PCR wordt gebruikt bij de detectie van genexpressie.

Conclusie

PCR en RT-PCR zijn twee belangrijke technieken die worden gebruikt in de moleculaire biologie. Zowel PCR als RT-PCR zijn geautomatiseerde technieken die in staat zijn tot het exponentieel verhogen van het aantal kopieën van een doelwit-DNA-sequentie, die wordt gedefinieerd door de voorwaartse en achterwaartse primers. Bij PCR wordt dubbelstrengig DNA als de matrijs gebruikt. Door middel van PCR kunnen DNA-klonering, DNA-sequentiebepaling en functionele analyse van de genen worden uitgevoerd. Bij RT-PCR kan genexpressie in een bepaald weefsel worden waargenomen door RNA te amplificeren. Het belangrijkste verschil tussen PCR en RT-PCR is de sjablonen die bij elke reactie en hun toepassingen worden gebruikt.   

Referentie:

1. "Polymerase kettingreactie (PCR)." Nationaal centrum voor informatie over biotechnologie. Amerikaanse National Library of Medicine, n.d. Web. Beschikbaar Hier. 1 juni 2017.
2. "Polymerase-kettingreactie (of PCR)." Klonen en moleculaire analyse van genen. N.p., n.d. Web. Beschikbaar Hier. 1 juni 2017. 
3. Biolabs, New England. "CDNA-synthese & RT-PCR." CDNA-synthese en RT-PCR | NEB. N.p., n.d. Web. Beschikbaar Hier. 1 juni 2017.

Afbeelding met dank aan:

1. "Polymerase kettingreactie" door Enzoklop - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA fragmendid etiidiumbromiidiga värvitud agaroosgeelis." By Rainis Venta - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Reverse transcriptie polymerase kettingreactie" door Jpark623 - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Eenfase vs tweestaps RT-PCR" door Jpark623 - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia