Verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers

Belangrijkste verschil - PCR Primers vs sequencing primers
 

Met de recente ontwikkelingen op het gebied van moleculaire biologie, werden verschillende genetische technieken ontwikkeld die de onderzoeksprocessen van verschillende wegen van het onderwerp eenvoudig en nauwkeurig maakten. PCR en andere sequencingprocedures zijn twee belangrijke van dergelijke technieken. Ze gebruiken verschillende subcomponenten. Primers worden beschouwd als de belangrijkste subcomponent die zowel bij PCR- als bij Sequencing-technieken voorkomt. PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie terwijl sequencingprimers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om zijn specifieke volgorde van de nucleotidensequentie te onthullen. Dit is de belangrijk verschil tussen PCR-primers en sequentiebepalingsprimers.

INHOUD

1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat zijn PCR-primers
3. Wat zijn Sequencing Primers
4. Overeenkomsten tussen PCR Primers en Sequencing Primers
5. Vergelijking zij aan zij - PCR Primers vs Sequencing Primers in tabelvorm
6. Samenvatting

Wat zijn PCR-primers?

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een genetische techniek die wordt gebruikt op het gebied van moleculaire biologie om een ​​enkele of enkele kopieën van een bepaald DNA-segment te versterken en om vele miljoenen identieke kopieën te verkrijgen. In een PCR-reactie worden verschillende componenten gebruikt waaronder primers. Primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidelengte van 18-25 die ze verenigbaar maken met de start- en eindregio van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd. Primers kunnen een voorwaartse primer en een reverse primer zijn. Deze primers binden aan het DNA-fragment op de specifieke punten waar het DNA-polymerase laat binden aan de specifieke primer op de locatie en de synthese van de nieuwe DNA-streng initiëren.

De selectie van primers is een belangrijk aspect van het PCR-proces. De selectie van de lengte van de primer is belangrijk. De ideale lengte zou 18-25 nucleotiden zijn. Als de lengte te kort of te lang is, zullen de primers niet binden aan de DNA-sequentie die nauwkeurig moet worden geamplificeerd. Primers die een te korte lengte hebben, leiden tot niet-specifieke primer-annealing op verschillende locaties van de DNA-sequentie.

Figuur 01: PCR-primers

Het Guanine- en Cytosine (GC) -gehalte in een goede primer moet in het bereik van 40-60 liggen. De primer-hybridisatietemperatuur en smelttemperatuur zijn vitale factoren tijdens PCR. De smelttemperatuur moet nauwkeurig worden berekend en de gloeiingstemperatuur van de primer moet 5 zijn ⁰C minder dan de smelttemperatuur. De smelttemperatuur moet 60 ° C en 75 ° C zijn. Te hoge of te lage temperaturen zullen resulteren in minder actieve DNA-polymerase-activiteit.

Wat zijn Sequencing Primers?

Sequentieprimers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. Voor het verkrijgen van goede sequencingresultaten zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Dus, wanneer primers worden geselecteerd, moeten ze uniek zijn voor een bepaald gebied waar we willen sequensen. Het zou ook met een correcte oriëntatie moeten zijn waarbij de sequenties gewoonlijk worden gegenereerd van 3 'naar 5'-uiteinden van de primers. De sequentie zou ongewenste zelf-hybridisatie moeten missen, zoals de vorming van haarspeldlussen. Het mag geen opeenvolgende vorming van Guanine-basen bevatten.

De smelttemperatuur (Tm) van de primer moet geschikt zijn voor de omstandigheden van de volgorde. Daarom zou het tussen 52 moeten liggen^OC en 74^OC. Bereiding van oligonucleotiden voor gebruik als een primer moet worden gezuiverd om de gewenste volledige lengte van de sequentie te verkrijgen. Als de oligonucleotiden onzuiverheden bevatten, zal de signalering van de primersequentie worden gesuperponeerd vanuit verschillende priminglocaties, en zal het ook het aantal basiscellen verminderen.

Figuur 02: Sequencing Primers

De primersmelttemperatuur (Tm) van een oligonucleotide bepaalt hoe sterk de complementaire DNA-strengen met elkaar worden gehybridiseerd. Tm kan worden beschouwd als een thermodynamische berekening waarbij het afhankelijk is van zowel DNA-sequenties als verschillende condities zoals zoutconcentratie. De Tm is belangrijk tijdens PCR, waarbij een variant die de cyclussequentiebepaling wordt genoemd, wordt gebruikt om een ​​groep van dideoxynucleotide-getermineerde fragmenten te produceren. Hier zal de primer waarvan de sequentie is bepaald aanvankelijk anneaal worden gegloeid, daarna verlengd en ten slotte gedenatureerd voor amplificatie. Daarom moet de Tm-waarde tussen 52 en 52 liggen^OC en 74^O C. Gesynthetiseerde oligonucleotiden kunnen worden verkregen uit DNA / RNA-syntheselaboratoria volgens keuze. De kleinschalige synthese die wordt gebruikt voor DNA-sequencing is gewoonlijk 50 nmol. Ook het allerbelangrijkste is dat de primers die worden gebruikt voor het bepalen van de sequentie moeten worden gezuiverd om vrij te zijn van onzuiverheden die de kwaliteitsvermindering zullen voorkomen.

Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR-primers en sequencing-primers?

• Zowel PCR Primers als Sequencing Primers zijn primers die worden gebruikt in het amplificatieproces van een gerichte DNA-sequentie.
• Zowel PCR Primers als Sequencing Primers zijn samengesteld uit nucleotiden.
• Zowel PCR Primers als Sequencing Primers zijn korte oligomeren.

Wat is het verschil tussen PCR Primers en Sequencing Primers?

PCR Primers versus Sequencing Primers
PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidesequentielengte van 18-25, waardoor ze verenigbaar zijn met het begin- en eindgebied van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd.	Sequencingprimers zijn korte oligomeren die worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen..
Functie
PCR-primers worden gebruikt voor amplificatie van een bepaalde DNA-sequentie.	Sequentieprimers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen.
Aantal benodigde primers
Twee primers; een voorwaartse primer en een reverse primer worden gebruikt als PCR-primers.	Heb maar één primer nodig als sequentiebepalingprimer.

Samenvatting - PCR Primers vs sequencing primers

Sequentieprimers worden gebruikt in de context van het sequencen van een DNA-fragment met de bedoeling om de specifieke identiteit ervan te onthullen. Eén sequentiebepalingsprimer is voldoende om het proces uit te voeren. Om goede sequencingresultaten te verkrijgen, zijn primers en sjablonen van hoge kwaliteit belangrijk. Dus, wanneer primers worden geselecteerd, moeten ze uniek zijn voor een bepaald gebied waar we willen sequensen. PCR-primers zijn korte DNA-strengen met een nucleotidelengte van 18-25 die compatibel is met het begin- en eindgebied van de DNA-fragmenten die moeten worden geamplificeerd. PCR-primers kunnen een voorwaartse primer en een reverse primer zijn. Het Guanine- en Cytosine (GC) -gehalte in een goede primer moet in het bereik van 40-60 liggen. De primer-uitgloeitemperatuur en smelttemperatuur zijn vitale aspecten tijdens PCR. Dit is het verschil tussen PCR-primers en sequencing-primers.

Referentie:

1. "Polymerase-kettingreactie (PCR)." Khan Academy. Beschikbaar Hier
2. "Sequentiëringsprimers en primerontwerp." Sequencingprimers en primerontwerp University Core DNA Services | Universiteit van Calgary. Beschikbaar Hier    

Afbeelding met dank aan:

1.'Primers RevComp'Bij Zephyris - Eigen werk, (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia 
2.'DNA Sequencin 3-etiketteringsmethoden'door Abizar (originele uploader) op Engelse Wikipedia - Overgebracht door Gustavocarra., (Public Domain) via Commons Wikimedia