Verschil tussen PCR en QPCR

Belangrijkste verschil - PCR versus QPCR

PCR (polymerasekettingreactie) en qPCR (kwantitatieve PCR) zijn twee technieken die in de biotechnologie worden gebruikt om DNA voor verschillende doeleinden te amplificeren. PCR is een relatief eenvoudige techniek. qPCR is ook bekend als real-time PCR of digitale PCR. De grootste verschil tussen PCR en qPCR is dat PCR is een kwalitatieve techniek, terwijl qPCR een kwantitatieve techniek is. PCR maakt het mogelijk het resultaat te lezen als "aanwezigheid of afwezigheid". Maar in qPCR wordt de hoeveelheid DNA die in elke cyclus wordt geamplificeerd, gekwantificeerd. Als RNA in PCR wordt gebruikt, staat de techniek bekend als RT-PCR (reverse transcriptie PCR) en als RNA wordt gebruikt in qPCR, staat de techniek bekend als qRT-PC.

Key Areas Covered

1. Wat is PCR
- Definitie, processen, gebruik
2. Wat is QPCR
- Definitie, processen, gebruik
3. Wat zijn de overeenkomsten tussen PCR en QPCR
- Overzicht van gemeenschappelijke functies
4. Wat is het verschil tussen PCR en QPCR
- Vergelijking van belangrijke verschillen

Sleutelbegrippen: Agarose gelelektroforese, amplicons, DNA-polymerase, fluorescerende kleurstof, PCR, probes, qPCR, RT-qPCR

Wat is PCR

PCR verwijst naar een techniek in de biotechnologie die de analyse van een korte DNA-sequentie mogelijk maakt door een geselecteerd segment van DNA te amplificeren. Het is een relatief gevoelige methode omdat zeer kleine volumes nodig zijn door een enkele reactie. De techniek is gebaseerd op het vermogen van DNA-polymerase om nieuwe strengen DNA op een complementaire manier te synthetiseren aan de aangeboden matrijsstreng. Het reactiemengsel van PCR bestaat uit DNA-polymerase, DNA-nucleotiden, primers, de DNA-matrijs die moet worden geamplificeerd en magnesium. De versterking wordt uitgevoerd in een thermocycler. DNA-polymerase moet hittebestendig zijn aangezien hoge temperaturen worden gebruikt in deze reactie. De twee typen DNA-polymerasen die bij PCR worden gebruikt, zijn Taq DNA-polymerase en pfu DNA-polymerase. Taq DNA-polymerase wordt veel gebruikt in PCR.

DNA-polymerase vereist een reeds bestaande DNA-streng aan het 3'-uiteinde om een nieuwe streng te synthetiseren. Derhalve wordt een oligonucleotide primer aan het reactiemengsel toegevoegd voor het initiëren van DNA-synthese. De eis van een primer in PCR maakt de amplificatie van slechts een specifiek gebied in de matrijs mogelijk. De doelsequentie wordt geflankeerd door voorwaartse en achterwaartse primers. Aan het einde van een PCR worden nieuwe exemplaren van een specifieke DNA-sequentie genoemd amplicons, zijn geaccumuleerd in miljarden. De componenten van de PCR moeten op een dergelijke manier worden geoptimaliseerd om de PCR-prestaties te verbeteren terwijl het falen tot een minimum wordt beperkt. De standaard PCR-reactie is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: PCR

Stappen van PCR

De drie stappen van een PCR worden hieronder beschreven.

Denaturation - De dubbelstrengige DNA-matrijs wordt gescheiden in twee enkele strengen door verwarming tot 94-95 ° C.
gloeien - Voorwaartse en reverse primers binden aan de complementaire sequenties in de template. De temperatuur hangt af van de smelttemperatuur van de primercombinatie.
Primerverlenging - DNA-polymerase-enzym verlengt elke primer aan hun 3'-uiteinde door complementaire basen aan de groeiende streng toe te voegen. De optimale temperatuur van Taq polymerase, d.w.z. 72 ° C, wordt gebruikt als de temperatuur in de extensiestap. De tijd van de uitbreiding hangt af van het aantal baseparen in de sjabloonstreng.

De drie stappen worden 28-35 keer herhaald. Agarosegelelektroforese wordt gebruikt bij de groottefractionering van PCR-producten. Het product wordt gekleurd met ethidiumbromide en wordt waargenomen onder UV. Het PCR-product of het geamplificeerde DNA kan worden gebruikt bij klonen, sequentiëren of genotypering.

Wat is QPCR

QPCR verwijst naar een techniek in de biotechnologie die de detectie, karakterisering en kwantificering van nucleïnezuren voor verschillende toepassingen mogelijk maakt. Daarom is het een soort kwantitatieve PCR. Zowel DNA als RNA kunnen worden gebruikt als qPCR. Als RNA als het sjabloon wordt gebruikt, moet het eerst reverse-getranscribeerd worden in cDNA. Dit type qPCR staat dus bekend als RT-qPCR. De traditionele PCR wordt uitgevoerd voor cDNA of gebruikelijk DNA-monster. In qPCR worden echter fluorescente kleurstoffen gebruikt om het PCR-product in elke stap van de PCR-cyclus te labelen. Dit maakt de verzameling van gegevens mogelijk terwijl de PCR voortschrijdt, waardoor de amplicons tijdens de exponentiële fase van de PCR kunnen worden gekwantificeerd. Het hoofdtype kleurstof dat wordt gebruikt in qPCR is SYBR Green. De kleurstof bindt zich aan het dubbelstrengige DNA. Naarmate de fluorescentie evenredig met de hoeveelheid geamplificeerd DNA wordt verhoogd, kan de kwantificatie in "real time" worden uitgevoerd. Het belangrijkste nadeel van het gebruik van de kleurstof is dat het de kwantificering van één specifiek product in het monster mogelijk maakt. Naast kleurstoffen kunnen probes ook in het kwantificatieproces worden gebruikt. TaqMan-probes zijn een van de hoofdtypen oligonucleotidesondes die worden gebruikt in qPCR en het proces van fluorescentie-emissie wordt weergegeven in Figuur 2.

Figuur 2: TaqMan-probe

Probes kunnen op een dergelijke manier worden ontworpen om verschillende PCR-producten binnen hetzelfde monster te detecteren. TaqMan-probe is een van de belangrijkste typen hydrolyseprobes; de opname van deze probe in het PCR-product stelt de fluorofoor bloot en emitteert de fluorescentie. Fluorescerende kleurstoffen zijn meer specifiek voor het PCR-product. Daarom worden ze in de meeste diagnostische testen gebruikt om het PCR-product te detecteren.

Overeenkomsten tussen PCR en QPCR

PCR en qPCR zijn twee soorten technieken die in de biotechnologie worden gebruikt om DNA voor verschillende doeleinden te amplificeren.
De traditionele polymerasekettingreactie wordt uitgevoerd als de kerntechniek in zowel PCR als qPCR.
RNA kan in zowel PCR als qPCR worden gebruikt door reverse transcriptie als de eerste reactie te gebruiken.

Verschil tussen PCR en QPCR

Definitie

PCR: PCR is een techniek in de biotechnologie die de analyse van een korte DNA-sequentie mogelijk maakt door een geselecteerd segment van DNA te amplificeren.

QPCR: QPCR is een techniek in de biotechnologie die de detectie, karakterisering en kwantificering van nucleïnezuren voor verschillende toepassingen mogelijk maakt.

Kwantitatief kwalitatief

PCR: PCR is een kwalitatieve techniek.

QPCR: QPCR is een kwantitatieve techniek.

Detectie van het product

PCR: Het product wordt gedetecteerd door de agarosegelelektroforese in PCR.

QPCR: Het product kan in elke amplificatiecyclus in qPCR worden gedetecteerd.

Verzameling van gegevens

PCR: De gegevens worden aan het einde van de reactie in PCR verzameld.

QPCR: De gegevens worden verzameld tijdens de exponentiële fase van de reactie in qPCR.

Resolutie

PCR: PCR heeft een zeer slechte resolutie.

QPCR: QPCR heeft een zeer hoge resolutie.

kleurstoffen

PCR: PCR gebruikt ethidiumbromide om het product tijdens PCR te kleuren.

QPCR: QPCR gebruikt fluorescente kleurstoffen om het product te detecteren.

Tijd

PCR: PCR is een meer tijdrovende methode.

QPCR: QPCR is minder tijdrovend.

RNA

PCR: RT-PCR is het type PCR dat RNA als sjabloon gebruikt.

QPCR: RT-qPCR is het type qPCR dat RNA als sjabloon gebruikt.

Rol

PCR: PCR wordt gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van bepaalde genomische fragmenten te detecteren.

QPCR: QPCR wordt gebruikt om een bepaald fragment in een monster te kwantificeren.

Conclusie

PCR en qPCR zijn twee soorten technieken die in de biotechnologie worden gebruikt om DNA voor verschillende doeleinden te amplificeren. PCR is de traditionele amplificatiemethode die wordt gebruikt om de aanwezigheid of afwezigheid van een DNA-fragment te identificeren. QPCR wordt gebruikt om een bepaald fragment in een monster te kwantificeren. PCR is dus een kwalitatieve techniek, terwijl qPCR een kwantitatieve techniek is. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR en qPCR.

Referentie:

1. "QPCR versus digitale PCR versus traditionele PCR." Thermo Fisher Scientific, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "PCR" door Madprime - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Taqman" Per gebruiker: Braindamaged - Eigen werk van de oorspronkelijke uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia

Wetenschap