Verschil tussen PCR en DNA-sequencing

Belangrijkste verschil - PCR versus DNA-sequentiebepaling
 

PCR en DNA-sequencing zijn twee belangrijke technieken in Molecular Biology. Polymerase Chain Reaction (PCR) is het proces dat een groot aantal kopieën van een DNA-fragment creëert. DNA-sequencing is de techniek die resulteert in de precieze volgorde van de nucleotiden van een bepaald DNA-fragment. Dit is het belangrijkste verschil tussen PCR en DNA-sequencing. PCR is een van de belangrijkste stappen bij DNA-sequencing.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is PCR
3. Wat is DNA-sequentiebepaling
4. Vergelijking zij aan zij - PCR versus DNA-reeksen
5. Samenvatting

Wat is PCR?

Polymerase Chain Reaction (PCR) is een DNA-amplificatietechniek die wordt gebruikt in Molecular Biology. Het produceert duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment. Deze methode werd ontwikkeld door Kary Mullis in 1983. In deze techniek dient het fragment van DNA dat moet worden geamplificeerd als het matrijs en DNA-polymerase-enzym voegt complementaire nucleotiden toe aan de primer die beschikbaar is in het PCR-mengsel. Aan het einde van de PCR-reactie worden vele kopieën van het monster-DNA gesynthetiseerd.

Er zijn verschillende componenten van het PCR-mengsel, waaronder DNA, DNA-polymerase (Taq-polymerase), primers (voorwaartse en achterwaartse primers), nucleotiden (bouwstenen van DNA) en een buffer. PCR vindt plaats in een PCR-machine en het juiste PCR-mengsel moet in de machine worden geladen en het juiste programma moet worden gebruikt. Deze techniek maakt de productie mogelijk van duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaalde sectie van DNA uit een zeer kleine hoeveelheid DNA.

PCR-reacties komen op een cyclische manier voor om de zichtbare hoeveelheid PCR-producten op een gel te produceren. Er zijn drie hoofdstappen betrokken bij een PCR-reactie, namelijk denaturatie, primer-uitgloeiing en strengverlenging zoals getoond in figuur 01. Deze drie stappen vinden plaats bij drie verschillende temperaturen. DNA bestaat in dubbelstrengs vorm door waterstofbruggen tussen de complementaire basen. Voorafgaand aan de implicatie, dubbelstrengs DNA moet van elkaar worden gescheiden. Het wordt gedaan door een hoge temperatuur te geven. Bij een hoge temperatuur dendert dubbelstrengig DNA in enkele strengen. Vervolgens moeten de primers dichter bij de flankerende uiteinden van het specifieke fragment of het gen van het DNA komen. Primer is een kort stuk enkelstrengig DNA dat complementair is aan de doelsequentie. Voorwaartse en achterwaartse primers versmelten met de complementaire basen aan de flankerende uiteinden van het gedenatureerde monster-DNA bij de hybridisatietemperatuur. Primers moeten hittebestendig zijn. Wanneer primers met monster-DNA zijn uitgewerkt, initieert taq-polymerase-enzym de synthese van de nieuwe strengen door nucleotiden toe te voegen die complementair zijn aan het doel-DNA. Taq-polymerase is een hitte-stabiel enzym dat wordt geïsoleerd uit een thermofiele bacterie die wordt genoemd Thermus aquaticus. PCR-buffer handhaaft de optimale omstandigheden voor de taq-polymerasewerking. Deze drie stadia van PCR-reacties worden herhaald om de vereiste hoeveelheid PCR-product te produceren. Na elke PCR-reactie wordt het aantal van de DNA-kopie verdubbeld. Derhalve kan een exponentiële amplificatie in PCR worden waargenomen. PCR-producten kunnen worden waargenomen met behulp van gelelektroforese en kunnen worden gezuiverd voor verdere studies.

Figuur 01: Belangrijke stappen van een PCR-reactie

PCR is een waardevol hulpmiddel in medisch en biologisch onderzoek. PCR heeft een speciale waarde in de forensische wetenschap omdat het DNA kan amplificeren voor onderzoeken van de kleine monsters van de criminelen en forensische DNA-profielen kan maken. PCR wordt veel gebruikt in veel gebieden van de moleculaire biologie, waaronder genotypering, genklonen, mutatiedetectie, DNA-sequencing, DNA-microarrays en vaderschapstesten, enz..

Figuur 02: Polymerase kettingreactie

Wat is DNA-sequentiebepaling?

DNA-sequencing is de bepaling van een precieze volgorde van de nucleotiden - adenine, guanine, cytosine en thymine in een bepaald DNA-fragment. Genetische informatie wordt opgeslagen in de DNA-sequenties met behulp van de juiste volgorde van de nucleotiden. Daarom is het erg belangrijk om de exacte volgorde van de nucleotiden in een DNA-fragment te vinden om over de structuur en functie van de genen te weten.

DNA-sequentiebepalingsprotocol omvat verschillende processen. De eerste stap is de isolatie van geïnteresseerd DNA of genomisch DNA van een organisme. Met behulp van PCR (zoals hierboven beschreven) moet het gewenste gebied van het DNA worden versterkt. Geamplificeerd PCR-product moet worden gescheiden door de gelelektroforese en worden gezuiverd. Geamplificeerde fragmenten worden als sjablonen voor sequencing bediend. Sequentiebepaling kan worden uitgevoerd volgens Sanger-sequencing of sequentiemethode met hoge doorvoer. Sanger-sequencing vereist capillaire elektroforese van resulterende DNA-fragmenten. Bepaling van de juiste nucleotide-volgorde kan worden gedaan door handmatige aflezing van autoradiogrammen of door middel van geautomatiseerde DNA-sequencers.

Gensequencing droeg bij aan het Human Genome-project en faciliteerde de mapping van het menselijk genoom in 2003. In de forensische geneeskunde maakte DNA-sequencing identificatie van individuen mogelijk die unieke DNA-sequenties vertonen en de criminelen identificeren. In de geneeskunde kan DNA-sequencing worden gebruikt om de genen te detecteren die verantwoordelijk zijn voor genetische en andere ziekten, om defecte genen te vinden en deze te vervangen door de juiste genen. In de landbouw wordt DNA-sequentiebepalingsinformatie van sommige micro-organismen gebruikt voor het produceren van transgene gewassen met economisch gewenste eigenschappen.

Figuur 03: DNA-reeksen

Wat is het verschil tussen PCR en DNA-sequencing?

PCR versus DNA-sequentiebepaling
PCR-proces creëert duizenden tot miljoenen kopieën van het geïnteresseerde DNA-fragment.	DNA-sequencing is het proces van het bepalen van de precieze volgorde van de nucleotiden in een bepaald DNA-fragment.
Resultaat
PCR creëert duizenden tot miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment	Dit resulteert in de juiste volgorde van de basen in een bepaald DNA-fragment.
Betrokkenheid van ddNTP's
PCR vereist geen ddNTP's. Het maakt gebruik van dNTP's.	DNA-sequencing vereist ddNTP's om strengvorming te beëindigen.

Samenvatting - PCR versus DNA-sequentiebepaling

PCR en DNA-sequencing zijn zeer belangrijke hulpmiddelen in veel gebieden van Molecular Biology. Amplificatie van de DNA-fragmenten wordt uitgevoerd door de PCR-techniek, terwijl de juiste volgorde van de nucleotiden van een DNA-fragment wordt bepaald door de DNA-sequentiebepaling. Dit is het verschil tussen PCR en DNA-sequencing.

Referentie:
1. "Polymerase kettingreactie (PCR)." Nationaal centrum voor informatie over biotechnologie. Amerikaanse National Library of Medicine, n.d. Web. 21 feb. 2017.
2. Shendure, Jay en Hanlee Ji. "DNA-sequencing van de volgende generatie." Nature News. Nature Publishing Group, 09 oktober 2008. Web. 21 feb. 2017

Afbeelding met dank aan:
1. "PCR-stappen" door Tinojasontran - Eigen werk (publiek domein) via Commons Wikimedia
2. "Polymerase kettingreactie" door Enzoklop - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "DNA-sequentie" door Sjef - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia