Hoe maak je een stabiele getransfecteerde cellijn
Share
Stabiele transfectie is de langdurige introductie van vreemd DNA in cellen. Stabiel getransfecteerde cellen passeren het vreemde DNA door het nageslacht. daarom, om stabiel getransfecteerde cellijnen te maken, moet vreemd DNA in het genoom van de cellijn worden geïntegreerd. Echter, stabiele overerving kan ook worden waargenomen in niet-genoom DNA. Een succesvolle, stabiele transfectie vereist effectieve werkwijzen voor DNA-aflevering alsook selectiewerkwijzen voor vreemd DNA binnen de cellijn. Stabiel getransfecteerde cellijnen worden gebruikt voor een breed scala van toepassingen, zoals de productie van recombinante eiwitten, genfunctiestudies, geneesmiddelontdekkingsassays, enz..
Key Areas Covered
1. Hoe maak je een stabiele getransfecteerde cellijn
- Stabiel Cellijn Generatie Protocol
2. Hoe getransfecteerd DNA in cellijn te selecteren
- Selectie van stabiel getransfecteerde cellijn
Sleutelbegrippen: Episomaal onderhoud, integratie in het genoom, plasmide, selectie, stabiel getransfecteerde cellijnen
Hoe maak je een stabiele getransfecteerde cellijn
Transfectie is een methode voor genoverdracht waarbij het genetische materiaal opzettelijk in de gastheercel wordt geïntroduceerd door chemische of niet-chemische methoden. Er zijn twee soorten stabiel getransfecteerde cellijnen:
- Het hoofdtype van stabiele cellijnen wordt gegenereerd door de directe integratie van getransfecteerd DNA in het genoom van het gastheerorganisme. Getransfecteerd DNA wordt geïntegreerd in het genoom door homologe recombinatie.
- De andere methode om stabiele cellijnen te genereren, is het episomale onderhoud van het getransfecteerde DNA. Eukaryote vectoren worden gebruikt bij de transfectie van DNA die niet in het genoom zijn geïntegreerd. De stabiliteit van episomaal DNA is echter laag. Ook worden episomen alleen gehandhaafd door bepaalde soorten soorten. Stabiel getransfecteerde cellijnen worden getoond in Figuur 1.
Figuur 1: stabiel getransfecteerde cellijnen
Werkwijze
De stappen die betrokken zijn bij het genereren van stabiele cellijnen worden hieronder beschreven.
- Generatie van een kill-curve die de optimale selectie antibioticumconcentratie bepaalt - Cellen worden onderworpen aan toenemende hoeveelheden antibioticumconcentratie om de minimale antibioticaconcentratie te bepalen die nodig is om alle cellen in een week te doden.
- Transfectie van cellen met gewenst plasmideconstruct - De methode van transfectie verschilt met het type gastheercellen. Liposoomreagentia worden gebruikt bij de transfectie van hechtende cellijnen. Elektrotransfectie of virale werkwijzen worden gebruikt om suspensie cellijnen te transfecteren.
- Selecteer en breid stabiele polyklonale kolonies uit - Na 48-72 uur transfectie worden hoge, optimale en lage concentraties selectieve antibiotica aan de kweken toegevoegd om de stabiel getransfecteerde cellijnen te verkrijgen.
Hoe getransfecteerd DNA in cellijnen te selecteren
Selectie markers worden mede tot expressie gebracht met het getransfecteerde DNA voor de selectie van met succes getransfecteerde cellen. Het markergen zou in dezelfde vector (cis) kunnen zijn die wordt gebruikt om de gastheercel of op een andere vector (trans) te transfecteren. De resistentie tegen antibiotica zoals neomycine, zeocine, hygromycine, puromycine, DHFR, enz. Kunnen bij de selectie worden gebruikt. Bovendien kunnen getransfecteerde genen worden gelabeld met GFP.
Conclusie
Stabiele cellijnen kunnen hoofdzakelijk worden gemaakt door getransfecteerd DNA in het genoom te integreren. Verder kan het episomale behoud van getransfecteerd DNA ook worden gebruikt om stabiele cellijnen gedurende een lange tijdsperiode in sommige gastheerorganismen te maken. Een selectiemethode zou er moeten zijn voor de identificatie van getransfecteerd DNA in de cellijn.
Referentie:
1. "Protocol van stabiele cellijngeneratie." Creatieve BioMart, Beschikbaar Hier.
Afbeelding met dank aan:
1. "Knockout mouse production 2" By Kjaergaard - Eigen werk (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
