Hoe primers voor PCR te maken

Primers zijn een essentiële component in de amplificatie van DNA beide in vivo en in vitro. In vivo, het enzym, DNA-polymerase vereist een primer voor de initiatie van DNA-replicatie. In vitro, primers worden meestal gebruikt voor de initiatie van polymerasekettingreactie (PCR). Sommige andere technieken, waaronder sequencing, klonen, plaatsgerichte mutagenese, enz. Vereisen primers. Vandaar dat het ontwerpen van primers voor in vitro technieken worden vrij eenvoudig, maar een uitdagend proces voor moleculair biologen. Daarom worden de basisregels voor het ontwerpen van de primer voor zowel PCR als sequencing in dit artikel besproken.

Key Areas Covered

1. Wat is een primer
     - Definitie, typen, rol
2. Hoe werken primers in een PCR
     - Kenmerken van DNA, PCR-proces
3. Hoe primers voor PCR te maken
     - Basisregels voor het ontwerpen van PCR-primers
4. Hoe een sequencing-primer te ontwerpen
    - Kenmerken van Sequencing Primers

Belangrijkste termen: DNA-synthese, Forward Primers, Length, Melting Temperature, PCR, Reverse Primers, Sequencing Primers

Wat is een primer

Een primer is een korte DNA- of RNA-streng die dient als startpunt voor DNA-synthese. De enzymen die DNA-replicatie katalyseren, zijn in staat om nucleotiden aan een bestaand 3'-uiteinde toe te voegen. Vandaar dat de primer de basis legt voor de DNA-synthese door als prime te dienen. RNA-primers worden in de cel gebruikt voor de initiatie van DNA-replicatie door DNA-polymerase. Echter, synthetisch DNA-primers kan worden gebruikt voor de amplificatie van DNA, voornamelijk door PCR en andere technieken. Twee soorten primers worden gebruikt in PCR en ze zijn bekend als voorwaartse en achterwaartse primers. Tijdens PCR kunnen miljoenen kopieën van het gewenste DNA-fragment worden geproduceerd door die specifieke DNA-sequentie in het genomische DNA te flankeren door voorwaartse en achterwaartse primers. Voorwaartse en reverse primer die een bepaalde DNA-sequentie flankeren, worden getoond in Figuur 1.

Figuur 1: Voorwaartse en omgekeerde primers

Hoe werken primers in PCR

DNA is een molecuul met twee strengen die bij elkaar worden gehouden. Het basenpaarpatroon is complementair aan elk in beide strengen. De twee strengen worden bij elkaar gehouden door de waterstofbruggen tussen complementaire stikstofbasen. Bovendien heeft elke streng zijn eigen richting. Eén streng heeft een richting van 5 'naar 3', terwijl de andere een richting van 3 'tot 5' heeft. Daarom zijn de twee strengen antiparallel. De streng met 5 'naar 3' richting staat bekend als de sense streng, terwijl de streng met 3 'naar 5' richting bekend staat als de antisense streng. Elke twee strengen zouden tijdens PCR afzonderlijk moeten worden gesynthetiseerd.

De drie PCR-stappen zijn denaturatie, hybridisatie en verlenging. Bij denaturatie worden de twee DNA-strengen gescheiden door de waterstofbindingen te verbreken door ze te verwarmen tot 95 ° C. Voorwaartse primer bindt aan de sense streng terwijl de reverse primer aan de antisense streng bindt. Het uitgloeien van primers vindt plaats wanneer de temperatuur daalt van 95 ° C tot 50-60 ° C. Vandaar dat beide strengen tegelijkertijd kunnen worden gesynthetiseerd met behulp van Taq polymerase. De versterking van zowel de sense- als de antisense-strengen vindt plaats in de richting 5 'naar 3'. Omdat PCR een exponentiële reactie is, worden de drie stappen herhaald in 25-35 cycli. Zowel voorwaartse als achterwaartse primers worden in elke cyclus gebruikt om ongeveer 2 te produceren³⁵ kopieën van gewenst DNA-fragment. De rol van primers in PCR is weergegeven in Figuur 2.

Figuur 2: PCR

Hoe primers voor PCR te maken

Om een ​​bepaald DNA-fragment in het genoom te amplificeren, moet dat specifieke DNA-fragment worden geflankeerd door zowel voorwaartse als reverse primers. Daarom moeten beide primers complementair zijn aan de sequenties die het DNA-fragment flankeren. De basisrichtlijnen voor het succesvolle ontwerp van PCR-primers worden hieronder beschreven.

1. De richting van zowel voorwaartse als teruggaande primer moet 5 'tot 3' zijn.
2. De lengte van elke primer moet tussen 18 en 25 nucleotiden lang zijn.
3. Het GC-gehalte van primers ligt tussen 40 en 60% en de aanwezigheid van een C of G in het 3'-uiteinde van de primer kan binding bevorderen..
4. De smelttemperatuur en Tm (de temperatuur waarbij de helft van de primer aan de mal is gegloeid) van het primerpaar moeten vergelijkbaar zijn en boven 60 ° C. Het maximale verschil moet 5 ° C zijn.
5. Het 3'-uiteinde van de primer zou precies moeten passen bij het template-DNA.
6. Ten minste 2G- of C-basen (GC-klem) moeten aanwezig zijn in de laatste 5 basen aan het 3'-uiteinde van de primer. De GC-klem bevordert een sterke binding aan de doelsequentie.
7. Restrictieplaatsen met 5-6 nucleotiden kunnen aan het 5'-uiteinde van de primer worden toegevoegd.
8. De dinucleotide-herhalingen (ATATATAT) of herhalingen van hetzelfde nucleotide meer dan 4 keer (ACCCC) moeten in de primersequenties worden vermeden. Dit veroorzaakt mispriming.
9. Intra-primer homologie of de secundaire structuren van primers moeten worden vermeden. Inter-primer homologie of complementaire sequenties in de voorwaartse en achterwaartse primers moeten worden vermeden. Beide aandoeningen kunnen zelfdimeren of primer-dimeren vormen.
10. De ΔG-waarde voor dimeeranalyse moet liggen tussen 0 en -9 kcal / mol.

Er zijn veel online hulpmiddelen beschikbaar voor het gemak van het primerontwerp zoals Primer 3, Primer X, NetPrimer, DNAstrar, etc. De specificiteit van de ontworpen primers kan worden bepaald door de hulpmiddelen zoals NCBI Primer-BLAST of UCSC in-silico PCR. 

Figuur 3: Primer 3-interface

Hoe een sequencing-primer te ontwerpen

Sequencingprimers zijn korte DNA-strengen, net als PCR-primers. PCR-primers zijn echter ontworpen voor de amplificatie van een bepaald DNA-fragment, terwijl sequentiebepalingsprimers worden gebruikt om de nucleotidesequentie van het geamplificeerde DNA-fragment door PCR te onthullen. Anders dan PCR-primers, kan een enkele primer worden gebruikt bij de sequentiebepaling, als alleen de doelwitsequentie minder dan 500 bp lang is. Als een voorbeeld kan de voorwaartse primer van de PCR worden gebruikt bij het bepalen van de sequentie, om alleen de sense streng te amplificeren. Bovendien is de mate van mismatches getolereerd gedurende de sequentiebepalingsreactie hoger dan de PCR. In het algemeen zijn PCR-primers complementair aan de doelsequentie. Sommige sequentiebepalingsprimers zijn echter niet gerelateerd aan de doelwitsequentie. Ze staan ​​bekend als universele primers. Universele primers zoals T7 of SP6 koppelen aan de vector die de doelsequentie draagt. Ze kunnen worden gebruikt voor zowel een verscheidenheid aan vectoren als verschillende soorten DNA-fragmenten.

Conclusie

Primers worden gebruikt bij PCR en sequencing voor de initiatie van de DNA-synthese. Twee soorten PCR-primers kunnen worden geïdentificeerd als voorwaartse en achterwaartse primer. Voorwaartse primers versmelten met de sense-streng terwijl reverse primers aan de antisense-streng hybridiseren. Bij sequentiebepaling kan een voorwaartse of een omgekeerde primer worden gebruikt om het doelwit te amplificeren. Tijdens het ontwerpen van primers, moeten veel factoren worden overwogen zoals primerlengte, Tm en GC-gehalte. Er zijn veel online hulpmiddelen beschikbaar die kunnen worden gebruikt voor het ontwerpen van primers voor een bepaalde reeks.

Referentie:

1. "Primerontwerp: tips voor een efficiënt proces." Genoom Compiler Corporation, 3 november 2015, hier beschikbaar.
2. "Sequentiëringsprimers en primerontwerp." Sequencingprimers en primerontwerp, University of Calgary, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Primers RevComp" door Zephyris - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Polymerase kettingreactie" door Enzoklop - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia