Hoe primers te ontwerpen voor sitegerichte mutagenese

Plaatsgerichte mutagenese (SDM) is een in vitro methode voor het maken van een mutatie in een bekende reeks. Het wordt vaak uitgevoerd door PCR-gebaseerde methoden. Gewoonlijk worden één of twee basen veranderd in plaatsgerichte mutagenese. Primers kunnen worden ontworpen met de gewenste mutaties voor het introduceren van kleine veranderingen in de nucleotidesequentie. Primerverlenging en inverse PCR kunnen worden gebruikt om grootschalige mutaties te introduceren. Deze benadering kan de aminozuursamenstelling van een bepaald eiwit veranderen. Plaatsgerichte mutagenese wordt gebruikt om de veranderingen in de activiteit van eiwitten te bestuderen. Het wordt ook gebruikt om ook fusie-eiwitten aan te maken.

Key Areas Covered

1. Wat is Site-Directed Mutagenesis (SDM)
      - Definitie, rol, methode
2. Hoe primers te ontwerpen voor plaatsgerichte mutagenese
     - Vervangingen, verwijderingen, invoegingen

Sleutelbegrippen: deleties, invoegingen, mutaties, site-gerichte mutagenese, substituties, traditionele PCR

Wat is Site-Directed Mutagenesis

Plaatsgerichte mutagenese is een moleculaire biologische techniek die wordt gebruikt om specifieke veranderingen in een nucleotidensequentie van een gen in te voeren. Het wordt gebruikt om de aminozuursequentie van een eiwit te veranderen, restrictieplaatsen te introduceren of te verwijderen, transcriptiebindingsplaatsen te vernietigen en fusie-eiwitten te creëren..

Werkwijze

Tijdens plaatsgerichte mutagenese worden de mutaties geïntroduceerd in de plasmiden met behulp van primers, bestaande uit de gewenste mutatie. De gehele template wordt geamplificeerd met PCR, waarbij de mutatie in de template wordt opgenomen. Vervolgens wordt de oudersjabloon uit het monster verwijderd met behulp van een enzym, methyleringsafhankelijk endonuclease. Het PCR-product of het geknipte plasmidemolecuul met de gewenste mutatie wordt getransformeerd in bacteriën. De plasmiden kunnen met gewenste modificaties uit de bacteriën worden geïsoleerd. Het proces van plaatsgerichte mutagenese wordt getoond in Figuur 1.

Figuur 1: Site-Directed Mutagenese

Drie hoofdtypen van werkwijzen worden gebruikt voor het introduceren van gewenste mutaties in plaatsgerichte mutagenese. Het zijn traditionele PCR, primerverlenging en inverse PCR. Primerverlenging en inverse PCR kunnen worden gebruikt om grootschalige nucleotide-veranderingen te introduceren.

Traditionele PCR

Traditionele PCR kan worden gebruikt voor het introduceren van één of twee nucleotide-veranderingen in de doelsequentie met gemodificeerde primers. De veranderingen kunnen nucleotidesubstituties, weglatingen of toevoegingen zijn. De mutatie wordt tijdens PCR in het amplicon geïncorporeerd. Daarom wordt de oorspronkelijke sequentie vervangen door de gemuteerde sequentie in de primer.

Primerverlenging

In primerverlenging wordt de gewenste mutatie opgenomen tijdens een geneste PCR. Hier wordt de doelsequentie geflankeerd door twee primers. De gewenste mutatie wordt opgenomen in de interne primer en de mutatie wordt geïntroduceerd in de tweede PCR-ronde. Over het algemeen neemt de specificiteit van een PCR-reactie af met het toegenomen aantal verkeerd gepaarde nucleotiden in de primers. Lange interne primers met grootschalige mutaties kunnen echter worden gebruikt bij primerverlenging, omdat geneste PCR de specificiteit van de PCR-reactie kan verhogen..

Inverse PCR

Inverse PCR is een werkwijze voor het amplificeren van onbekende DNA-fragmenten door primers te ontwerpen voor een bekende DNA-sequentie. Het kan worden gebruikt voor het substitueren, verwijderen of invoegen van nucleotiden op grote schaal.

De toepassingen van plaatsgerichte mutagenese worden hieronder beschreven.

1. Om de structuur, functie en katalytische eigenschappen van eiwitten te bestuderen
2. De eigenschappen van eiwitten verbeteren (eiwittechnologie)
3. Om plaatsen voor restrictie-endonucleasen te introduceren of te verwijderen.

Hoe primers te ontwerpen voor plaatsgerichte mutagenese

Plaatsgerichte mutagenese is een proces van introductie van de gewenste mutatie door middel van een primer. De mutatie kan een substitutie, invoeging of verwijdering zijn. Naarmate de specificiteit van PCR afneemt met de toenemende niet-overeenkomende nucleotiden in de primer, kan traditionele PCR slechts één of twee basenpaarveranderingen introduceren in de doelsequentie. Andere methoden zoals primerverlenging en inverse PCR kunnen worden gebruikt om grootschalige mutaties te introduceren. Het primerontwerp in plaatsgerichte mutagenese wordt getoond in Figuur 2.

Figuur 2: Primers voor plaatsgerichte mutagenese

vervanging

Voor substituties moet een van de twee primers de gewenste mutatie in het midden van de primer bevatten. Hier, de site die de mutatie bevat, koppelt niet aan de doelsequentie omdat het een vervorming vormt.

verwijdering

Voor verwijderingen kan de te verwijderen reeks uit het doel worden verwaarloosd tijdens het ontwerp van de primer. Omdat deze sequentie zich afgeeft van het geflankeerde gebied door primers, zou het niet worden geamplificeerd tijdens PCR.

Invoeging

Voor inserties is de toe te voegen sequentie verweven met het 5'-uiteinde van één van de primers tijdens het primerontwerp. Daarom kan de ingevoegde sequentie ook aan het amplicon blijven gehecht.

Conclusie

Plaatsgerichte mutagenese is een techniek die wordt gebruikt om mutaties in een DNA-sequentie te introduceren. Deze mutaties kunnen substituties, inserties of deleties zijn. Kleinschalige mutaties kunnen in de traditionele PCR worden geïntroduceerd. Grootschalige mutaties kunnen worden geïntroduceerd in primerverlenging of inverse PCR. De introductie van de mutatie wordt gedaan door incorporatie van de gewenste mutatie in de primer. 

Referentie:

1. "Methoden voor plaatsgerichte mutagenese." GEÏNTEGREERDE DNA-TECHNOLOGIEËN, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "Site Directed Mutagenesis" door Knbusby - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia