Hoe primers voor QPCR te ontwerpen

Kwantitatieve of real-time PCR wordt gebruikt als een routinetest voor het volgen van de relatieve veranderingen in genexpressie onder verschillende experimentele omstandigheden. Het ontwerpen van primers en probes tijdens QPCR is een van de meest cruciale factoren die de kwaliteit en het succes van de test beïnvloeden. Verschillende richtlijnen zijn van toepassing op het ontwerp van primers voor QPCR: GC-gehalte van primers moet 35-65% zijn; smelttemperatuur van de primers moet binnen 60-68 ° C zijn; men moet ook secundaire structuren vermijden, de herhalingen van Gs of Cs die langer zijn dan 3 basen, en de vorming van primer-dimeren.

Key Areas Covered

1. Wat is QPCR
- Definitie, proces, gebruik
2. Hoe primers voor QPCR te ontwerpen
- Richtlijnen voor het primerontwerp voor QPCR

Belangrijkste termen: Fluorescerende kleurstoffen, GC-gehalte, smelttemperatuur, primers, kwantitatieve PCR (QPCR)

Wat is QPCR

QPCR is een type PCR dat de kwantificering van het product in realtime mogelijk maakt. Fluorescerende kleurstoffen kunnen worden gebruikt voor het kwantificeren van PCR-producten door ze in elke stap te labelen. Twee methoden van fluorescente labeling kunnen worden gebruikt in QPCR-assays. Ze zijn het gebruik van fluorescente kleurstoffen en de fluorescent gelabelde probes. Fluorescerende kleurstoffen binden aan het PCR-product terwijl probes met het PCR-product worden verbonden om een stabiel triplex-DNA te vormen. De veel gebruikte fluorescente kleurstof in QPCCR is SYBR Green, terwijl de sondes Taqman kunnen zijn. Het gebruik van probes bij de detectie van PCR-producten tijdens QPCR geeft meer nauwkeurige resultaten en verhoogt de gevoeligheid van de test.

Figuur 1: Mechanisme van QPCR

Hoe primers voor QPCR te ontwerpen

Het ontwerpen van primers voor QPCR is cruciaal voor het vergroten van de betrouwbaarheid, nauwkeurigheid en de gevoeligheid van de test. Richtlijnen voor het ontwerp van QPCR-primers worden hieronder beschreven.

PCR-product / Amplicon-grootte - De grootte van het PCR-product moet 50-210 basenparen groot zijn.
Primer lengte - De lengte van de primers moet 19-23 nucleotiden zijn.
GC-gehalte - Het GC-gehalte van primers moet 35-65% zijn.
Smeltpunt (Tm) - De smelttemperatuur van de primers moet 60-68 ° C zijn. De annealingstemperatuur voor de test is 5 ° C lager dan de Tm van de primers.
Exon-exon junctie - Bij het amplificeren van cDNA door QPCR moeten de primers de exon-exon junctie overspannen om de amplificatie van het contaminerende DNA te voorkomen.
Herhaalt en loopt - Dinucleotide-herhalingen (TCTCTCTCTC) en herhaalde nucleotiden (bijv. TAAAAAAAGC) moeten worden vermeden.
3 'Complementariteit - De complementaire gebieden van de 3'-uiteinden van voorwaartse en achterwaartse primers moeten worden vermeden om de vorming van primerdimeren te voorkomen.
3 'Stabiliteit - G- of C-residuen moeten worden opgenomen aan het 3'-uiteinde van de primer om de stabiliteit van de uitgloeiing te vergroten.
GC-klem - Eén of twee GC-klemmen aan het 5'-uiteinde van de primer verhogen de specificiteit van het uitgloeien.
Specificiteit - De specificiteit van de primers moet worden gecontroleerd door BLAST
SNP's - Primers mogen geen bekende SNP-variaties (single nucleotide polymorphism) bevatten

Verschillende online tools kunnen worden gebruikt in het primerontwerp in QPCR, zoals Primer3, Primer-BLAST, IDT PrimerQuest, Primer Bank en OAT.

Figuur 2: Vorming van primer-dimeren

Primers moeten op een zodanige manier worden ontworpen dat de vorming van primerdimeren in QPCR wordt vermeden. Het is van cruciaal belang bij het gebruik van fluorescerende kleurstoffen voor de detectie van het PCR-product, omdat deze kleurstoffen ook binden met de primerdimeren om vals-positieve resultaten te geven.

Conclusie

QPCR wordt gebruikt bij de detectie en kwantificatie van PCR-producten. Het ontwerpen van primers is cruciaal in QPCR om de nauwkeurigheid van de resultaten te vergroten. Het is dus belangrijk om de richtlijnen zorgvuldig te volgen bij het ontwerpen van primers voor QPCR.

Referentie:

1. "QPCR-testontwerp en -optimalisatie." LSR | Bio-Rad, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Taqman" Per gebruiker: Braindamaged - Eigen werk van de oorspronkelijke uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Primer dimers formation En" By Tzachi Bar - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia

Wetenschap