Hoe Transfectie-efficiëntie te berekenen

Transfectie-efficiëntie kan worden berekend door het aantal cellen dat is getransfecteerd over de totale cellen in een bepaald monster te tellen. Het aantal cellen kan op twee manieren worden geteld. De meest gebruikte methode is om makkelijk hanteerbare reporters te gebruiken. Deze reporters kunnen groen fluorescentie-eiwit (GFP), luciferase, beta-galactosidase, uitgescheiden alkalische fosfatase (SEAP) zijn. De meest recente methode voor het berekenen van de transfectie-efficiëntie is het labelen van nucleïnezuren, waardoor de intracellulaire afgifte van deze nucleïnezuren kan worden gevolgd. Sommige andere benaderingen zoals Western-blotting, immunokleuring en functionele testen kunnen ook worden gebruikt voor het berekenen van transfectie-efficiëntie. Aangezien de transfectie-efficiëntie afhangt van meerdere experimentele parameters, is de bepaling van de transfectie-efficiëntie de sleutel om de invloed van verschillende factoren op transfectie te bepalen.

Key Areas Covered

1. Wat zijn de methoden die worden gebruikt om transfectie-efficiëntie te berekenen
     - Reporter Systems
2. Hoe Transfectie-efficiëntie te berekenen
     - Cel tellen

Sleutelbegrippen: Flow Cytometry, GFP, Nucleic Acid Labelling, Reporter System, Transfection Efficiency

Wat zijn de methoden die worden gebruikt om transfectie-efficiëntie te berekenen

Verschillende soorten methoden worden gebruikt om de transfectie-efficiëntie te berekenen.

1. Reportersystemen

- Groen fluorescent eiwit (GFP) - GFP is van nature te vinden in kwallen. Het wordt gebruikt voor zowel kwalitatieve als kwantitatieve analyse van getransfecteerde cellen door gelijktijdige transfectie van het GFP-gen met het gen van belang. Kwalitatieve analyse kan worden uitgevoerd onder een fluorescentiemicroscoop. Kwantitatieve analyse kan worden uitgevoerd door flowcytometrie. Naast GFP kunnen ook rood fluorescentie-eiwit (RFP) en geel fluorescent eiwit (YFP) worden gebruikt als reporters. E coli kolonies die fluorescente proteïnen tot expressie brengen wordt getoond in Figuur 1.

Figuur 1: Fluorescerende eiwitten

• luciferase - Luciferase wordt van nature aangetroffen in vuurvliegjes en genereert licht. Luciferasetests zijn zeer gevoelig en kunnen worden gebruikt voor de kwantitatieve analyse van getransfecteerd DNA.
• Betagalactosidase - Beta-galactosidase is gevonden in E coli. Het wordt gebruikt in de kwalitatieve analyse gedaan met X-gal en de kwantitatieve analyse uitgevoerd door colorimetrische, fluorescente of chemiluminescente methoden.
• Afgescheiden alkalische fosfatase (SEAP) - SEAP is een warmtestabiele reporter, die wordt uitgescheiden door zoogdiercellen wanneer deze tot expressie wordt gebracht.

2. Nucleic Acid Labeling - Fluorescentie-gemerkte plasmiden kunnen bij de transfectie worden gebruikt. Daarna kunnen ze worden geteld onder een fluorescentiemicroscoop.

3. Western-blotting, immunokleuring en andere functionele testen

Hoe Transfectie-efficiëntie te berekenen

Het aantal cellen dat de reporter vertoont en het aantal cellen dat de reporter niet vertoont, kan worden geteld onder een microscoop of door flowcytometrie. Het percentage cellen dat de reporter vertoont, geeft de transfectie-efficiëntie.

Figuur 2: Transfectie-efficiëntie

Conclusie

Transfectie-efficiëntie kan worden berekend door het aantal cellen te bepalen dat getransfecteerd DNA vertoont over het totale aantal cellen in het monster. Het aantal cellen kan worden berekend onder de microscoop of door flowcytometrie met behulp van een reportersysteem.

Referentie:

1. "Maatregel transfectie-efficiëntie." Mirus Bio LLC, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "E. coli die fluorescerende eiwitten tot expressie brengt "Door Erin Rod - Eigen werk, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia