Hoe werkt Western Blotting

Western blotting is een techniek in de moleculaire biologie die wordt gebruikt bij de detectie van een specifiek eiwit in een monster. Het maakt gebruik van SDS-PAGE om eiwitten te scheiden op basis van hun grootte en deze gescheiden eiwitten worden vervolgens overgebracht naar een membraan. Deze techniek gebruikt specifieke primaire antilichamen bij het labelen van een bepaald eiwit in de blot. Secundaire antilichamen die zijn gemerkt met reportereiwitten detecteren de gelabelde eiwitten met het primaire antilichaam.

Key Areas Covered

1. Wat is Western Blotting
     - Definitie, feiten, toepassingen
2. Hoe werkt Western Blotting
     - Proces van Western Blotting

Sleutelbegrippen: kleurontwikkeling, nitrocellulosemembraan, primair antilichaam, secundair antilichaam, Western Blotting

Wat is Western Blotting

Western blotting is een hybridisatietechniek die wordt gebruikt bij de detectie van een bepaald eiwit in een monster. Het wordt ook immunoblotting genoemd omdat de techniek antilichamen gebruikt voor zowel het van belang zijn van het eiwit als de detectie van de met antilichaam gemerkte eiwitten.

Figuur 1: Western Blot

Western-blotting werd voor het eerst ontwikkeld door Towbin in 1979, en het wordt momenteel gebruikt als een routinematige techniek van eiwitanalyse. 

Hoe werkt Western Blotting

Western blotting wordt voornamelijk gebruikt bij de detectie van een specifiek eiwit in een monster. De stappen van de Western-blotting-techniek worden hieronder beschreven.

1. SDS-PAGE - Het eiwitmonster wordt gescheiden op basis van hun grootte door SDS-PAGE.
2. Eiwitten overbrengen naar een membraan - De op grootte gefractioneerde eiwitten worden overgebracht in ofwel een nitrocellulose- of polyvinylideendifluoride (PVDF) -membraan. De technieken die bij deze overdracht zijn betrokken, zijn diffusieoverdracht.
3. Het blokkeren van niet-specifieke sites - De niet-bezette plaatsen op het membraan zijn geblokkeerd om de niet-specifieke binding van eiwitten te voorkomen. Hiervoor mag niet-droge melk of runderserumalbumine (BSA) worden gebruikt.
4. Primaire antilichaamincubatie - Het geblokkeerde membraan wordt geïncubeerd met een primaire antilichaamoplossing. Deze primaire antilichamen binden aan een bepaald eiwit op het membraan.
5. Secundaire antilichaamincubatie - Het membraan wordt geïncubeerd met secundaire antilichamen die aan de primaire antilichamen binden. Secundaire antilichamen worden geconjugeerd aan reportereiwitten. Deze reportereiwitten kunnen biotine, alkalische fosfatase of mierikswortelperoxidase zijn.
6. Eiwitdetectie door kleurontwikkeling - De geconjugeerde enzymreporters reageren met hun substraat om een ​​gekleurd Alkaline fosfatase te genereren dat BCIP omzet in een blauw kleurproduct, terwijl mierikswortelperoxidase luminol omzet en luminescentie uitstraalt.

Figuur 2: Western-blotting - procedure

Conclusie

Western blotting is een hybridisatietechniek die wordt gebruikt bij de detectie van de aanwezigheid van een bepaald eiwit in een monster. Het maakt gebruik van SDS-PAGE om eiwitten te scheiden op basis van hun grootte en binding met primaire antilichamen, die tijdens de ontwikkeling van de kleur door secundaire antilichamen kunnen worden herkend.

Referentie:

1. "Western Blotting fundamenteel principe, hoe Western Blots werken." Boster, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "Anti-liponzuur immunoblot" door TimVickers - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Western Blotting" door Cawang - Eigen werk, CC0) via Commons Wikimedia