Verschil tussen omgekeerde fase en hydrofobe interactiechromatografie

De grootste verschil tussen omgekeerde fase en hydrofobe interactie chromatografie is dat de omgekeerde fase chromatografie (RPC) maakt gebruik van een meer hydrofoob medium, wat leidt tot sterkere interacties terwijl de hydrofobe interactie chromatografie (HIC) een minder hydrofoob medium gebruikt in vergelijking met het medium in de omgekeerde fase chromatografie.  

Omgekeerde fase chromatografie en hydrofobe interactie chromatografie zijn twee chromatografische technieken die afhankelijk zijn van de interacties tussen hydrofobe oppervlakken van een chromatografiemedium en de hydrofobe pleisters op het oppervlak van biomoleculen.

Key Areas Covered

1. Wat is Reverse Phase Chromatography
     - Definitie, stappen, toepassingen
2. Wat is Hydrophobic Interaction Chromatography
     - Definitie, stappen, toepassingen
3. Wat zijn de overeenkomsten tussen omgekeerde fasenscheiding en hydrofobe interactiechromatografie
     - Overzicht van gemeenschappelijke functies
4. Wat is het verschil tussen omgekeerde fasechromatografie en hydrofobe interactiechromatografie
     - Vergelijking van belangrijke verschillen

Sleutelbegrippen

Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC, Media, Reverse Phase Chromatography, RPC

Wat is Reverse Phase Chromatography

Omgekeerde fase chromatografie (RPC) is een chromatografische techniek die wordt gebruikt voor de zuivering en analyse van biomoleculen zoals eiwitten, peptiden en oligonucleotiden. Het geeft een scheiding met hoge resolutie en is ideaal voor het controleren van peptiden en het controleren van de zuiverheid. RPC wordt vaker gebruikt bij het uiteindelijke polijsten van peptiden en oligonucleotiden.

Twee hoofdtypen hydrofobe media kunnen worden gebruikt als de stationaire fase: silicakorrels bedekt met koolstofketens of naakte hydrofobe polymeren. Een kolom is gepakt met de hydrofobe media in de vorm van een gepakt bed waarop het monster wordt aangebracht. Een ion-paring-middel zoals trifluorazijnzuur (TFA) kan aan de mobiele fase worden toegevoegd om de vorming van hydrofobe interacties te verbeteren. Een organische modificator zoals 5% acetonitril wordt in het begin gebruikt en de elutie kan worden gestart met het verhogen van het percentage acetonitril.

Figuur 1: Reverse Phase Chromatography Theory

Biomoleculen die minder hydrofoob / meer polair zijn zullen eerst elueren, terwijl de meer hydrofobe moleculen later zullen elueren. RPC is de chromatografische techniek met de hoogste resolutie.

Wat is Hydrophobic Interaction Chromatography

Hydrofobe interactiechromatografie (HIC) is de andere techniek die wordt gebruikt voor de scheiding van biomoleculen op basis van de hydrofobiciteit onder gematigde omstandigheden. Het is een ideale techniek voor de zuivering van eiwitten wanneer de monsters moeten worden onderworpen aan ammoniumsulfaatprecipitatie in de initiële monsterconcentratie en opruiming. Het verhoogde zoutniveau tijdens de ammoniumsulfaatprecipitatie verhoogt de interactie tussen hydrofobe componenten.

Figuur 2: Effect van hoge zoutconcentratie op hydrofobe interacties

Het hydrofobe medium van HIC bestaat uit een inerte matrix van bolvormige deeltjes bekleed met liganden die alkyl- of arylgroepen bevatten. De hydrofobe interacties komen voor onder matig hoge zoutconcentraties (typisch 1-2 M ammoniumsulfaat of 3 M NaCl). De startbuffer verzekert de binding van eiwitten van belang aan het medium tijdens het wegwassen van de onzuiverheden. De elutiebuffer bevat een lage zoutconcentratie, waardoor de interactie tussen eiwitten en de stationaire fase wordt verzwakt.

Overeenkomsten tussen omgekeerde fase-chromatografie en hydrofobe interactiechromatografie

• Omgekeerde fase en hydrofobe interactiechromatografie zijn twee technieken die worden gebruikt bij de scheiding van biomoleculen op basis van hun hydrofobiciteit.
• De mobiele fase van beide technieken is water of een organisch oplosmiddel.
• Ze gebruiken kolommen met een gepakt bed.
• Startbuffer zorgt voor de binding van gewenste moleculen aan de kolom.
• Moleculen met de laagste hydrofobiciteit kunnen eerst elueren, terwijl meer hydrofobe moleculen later kunnen elueren.
• De laatste wasstap elueert de meest strak gebonden moleculen.
• De resolutie van beide technieken is een combinatie van de selectiviteit (mate van scheiding tussen de pieken), efficiëntie (het vermogen om smalle, symmetrische pieken te produceren) van de techniek, de massa van het monster en de retentietijd.

Verschil tussen omgekeerde fasechromatografie en hydrofobe interactiechromatografie

Definitie

Reverse-fase chromatografie (RPC) verwijst naar de scheidingstechniek met de hoogste resolutie op basis van de hydrofobiciteit van de moleculen in een mengsel, terwijl hydrofobe interactiechromatografie (HIC) verwijst naar een type scheidingstechniek op basis van de hydrofobiciteit maar werkt onder relatief milde omstandigheden.

hydrofobiciteit

De RPC werkt onder meer hydrofobe omstandigheden, terwijl de HIC werkt onder relatief milde hydrofobe omstandigheden.

interacties

Omgekeerde fase chromatografie leidt tot sterkere interacties tussen moleculen en de stationaire fase die tijdens elutie moet worden omgekeerd door een organische modifier, terwijl HIC leidt tot matig hoge interacties tussen de stationaire fase en de moleculen.

Hydrofobe media

RPC gebruikt silica-korrels bedekt met koolstofketens of naakte hydrofobe polymeren, terwijl HIC een inerte matrix van bolvormige deeltjes bekleed met liganden die alkyl- of arylgroepen bevatten, gebruikt.

Start Buffer

De startbuffer in RPC gebruikt trifluorazijnzuur (TFA), terwijl de startbuffer van HIC matig hoge zoutconcentraties gebruikt.

elutie

Het verhoogde percentage acetonitril begint de elutie in RPC terwijl de afnemende zoutconcentratie begint met de elutie in HIC.  

Resolutie

Omkeerfasechromatografie is de chromatografische techniek met de hoogste resolutie, terwijl de resolutie van HIC laag is in vergelijking met RPC.

toepassingen

RPC wordt gebruikt bij de scheiding van eiwitten, peptiden en oligonucleotiden, terwijl HIC voornamelijk wordt gebruikt bij de zuivering van eiwitten.

Conclusie

De omgekeerde fase chromatografie is de chromatografische techniek met de hoogste resolutie, die werkt onder sterk hydrofobe omstandigheden. Maar HIC werkt onder gematigde hydrofobe omstandigheden. RPC en HIC zijn de twee soorten scheidingstechnieken op basis van de hydrofobiciteit. Het belangrijkste verschil tussen RPC en HIC is de mate van hydrofobiciteit die in elke techniek wordt gebruikt.

Referentie:

1. Hydrophobic Interaction and Reversed Phase Chromatography: Principles and Methods. GE Healthcare, 2006. Hier beschikbaar

Afbeelding met dank aan:

1. "Reverse Elution Schematic Phase Gradient" door Nategm - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia   
2. "Hicsalt" door Daliak op Engelse Wikibooks - Overgezet van en.wikibooks naar Commons. (Public Domain) via Commons Wikimedia