Verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing

Belangrijkste verschil - Maxam Gilbert versus Sanger-reeksen
 

Nucleotiden zijn de structurele basiseenheden en bouwstenen van DNA. DNA-molecuul bestaat uit een polynucleotide-keten. Er zijn vier verschillende nucleotiden gevonden in DNA. Deze nucleotiden zijn samengesteld uit vier verschillende stikstofhoudende basen genaamd A (adenine), G (guanine), C (cytosine), T (thymine). De volgorde van de nucleotiden in het DNA-molecuul is van groot belang omdat het codeert voor een belangrijke genetische informatie voor de groei en ontwikkeling van organismen. DNA-sequencing verwijst naar het proces dat de precieze nucleotidesequentie van het DNA bepaalt. Er zijn verschillende DNA-sequentiemethoden. Maxam Gilbert-sequencing en Sanger DNA-sequencing zijn twee methoden voor DNA-sequencing die behoren tot de eerste generatie sequencing. Maxam Gilbert sequentiebepalingswerkwijze bepaalt de basensequentie door het chemisch splitsen van de 5'-uiteinde gemerkte DNA-fragmenten bij voorkeur op elk van vier nucleotiden en gelelektroforese. Sanger-sequencingprocedure bepaalt de nucleotidesequentie door enkelstrengig DNA te synthetiseren met behulp van DNA-polymerase en dideoxynucleotiden en gelelektroforese. Dit is het belangrijkste verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Maxam Gilbert
3. Wat is Sanger-sequencing
4. Vergelijking zij aan zij - Maxam Gilbert versus Sanger Sequencing
5. Samenvatting

Wat is Maxam Gilbert Sequencing?

Maxam Gilbert-sequencing, ook bekend als chemische sequentiemethode, is een techniek die is ontwikkeld om de volgorde van de nucleotiden in DNA te bepalen. Deze methode werd geïntroduceerd door Walter Gilbert en Alan Maxam in 1976 en werd populair omdat het direct met gezuiverd DNA kan worden uitgevoerd. De Maxam Gilbert-methode behoort tot de eerste generatie van DNA-sequencing en het was de eerste methode voor het bepalen van sequenties die veel wordt gebruikt door wetenschappers.

Het basisprincipe van deze methode ligt in de beperking van de eind-gelabelde DNA-fragmenten op specifieke basen door basispecifieke chemicaliën en omstandigheden en de scheiding van de gemerkte fragmenten door elektroforese zoals weergegeven in figuur 01. Fragmenten worden gescheiden volgens hun groottes op de gel. Omdat de fragmenten zijn gelabeld, kan de sequentie van het DNA-molecuul gemakkelijk worden afgeleid.

Maxam gilbert-methode maakt gebruik van basisspecifieke chemicaliën om DNA op specifieke basen te breken. Twee veelgebruikte chemicaliën genaamd dimethylsulfaat en hydrazine chemicaliën worden gebruikt om selectief respectievelijk purines en pyrimidines aan te vallen.

Maxam Gilbert-sequentiemethode wordt als volgt via verschillende stappen uitgevoerd.

1. Zuivering van de DNA-sequentie met behulp van restrictie-endonucleasen
2. Labeling van de uiteinden van de DNA-fragmenten door toevoeging van radioactieve fosfaten
3. Zuivering van de gelabelde fragmenten van niet-gemerkte fragmenten door middel van gelelektroforese
4. Scheiding van het uiteinde-gelabelde DNA in vier buizen en behandeling met basisspecifieke chemicaliën afzonderlijk
5. Elektroforese van de inhoud van elke buis op afzonderlijke lijnen op een gel en fragmentscheiding volgens hun lengte.
6. Detectie van de fragmenten door autoradiografie.

Figuur 01: Maxam Gilbert Sequencing

Wat is Sanger-sequencing?

Sanger Sequencing is een sequentiemethode ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn collega's in 1977 om de basensequentie van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als ketenbeëindigingssequencing of Dideoxy-sequentiemethode. Deze methode werkt op het principe van selectieve incorporatie van ketenafsluitende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de synthese van enkelstrengs DNA om strengvorming te beëindigen. Dideoxynucleotiden missen 3'-OH-groepen voor de vorming van fosfodiesterbindingen met aangrenzend nucleotide. Daarom stopt de strengvorming wanneer eenmaal een ddNTP is ingebouwd in nieuw vormende streng gedurende het rangschikken van sanger-sequenties.

In deze methode worden vier afzonderlijke DNA-synthesereacties (PCR) uitgevoerd in vier afzonderlijke buizen met één type ddNTP. Andere vereisten worden ook geleverd voor de buizen voor PCR, waaronder primers, dNTP's, Taq-polymerase, specifieke omstandigheden, enz. Vier afzonderlijke reacties worden uitgevoerd in vier buizen met vier mengsels. Na PCR-reacties worden de resulterende DNA-fragmenten thermisch gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Vervolgens worden de fragmenten gevisualiseerd met behulp van een gelabelde (radioactieve of fluorescerende) primer of dNTP's zoals weergegeven in afbeelding 02.

Figuur 02: Sanger-sequencing

Wat is het verschil tussen Maxam Gilbert en Sanger Sequencing?

Maxam Gilbert versus Sanger-reeksen
Maxam Gilbert-sequencing is de eerste techniek die is ontwikkeld voor DNA-sequencing.	Sanger sequencing-methode werd geïntroduceerd na de Maxam Gilbert-sequentiemethode.
Gebruik
Deze methode wordt zelden gebruikt.	Sanger-sequencing wordt routinematig gebruikt voor sequencing.
Gebruik van gevaarlijke chemicaliën
Het maakt gebruik van gevaarlijke chemicaliën.	Het gebruik van gevaarlijke chemicaliën is beperkt in vergelijking met de Maxam Gilbert-methode.
Labelling voor detectie
Deze methode maakt gebruik van radioactieve P32 voor het labelen van de uiteinden van de DNA-fragmenten.	Sanger-sequencing maakt gebruik van radioactief of fluorescent gelabelde ddNTP's.

Samenvatting - Maxam Gilbert versus Sanger Sequencing

Maxam Gilbert en Sanger-sequencing zijn twee soorten DNA-sequentietechnieken die onder de DNA-sequencing van de eerste generatie vallen. Maxam Gilbert-sequencing is de eerste methode die is geïntroduceerd voor DNA-sequencing in 1976, en wordt uitgevoerd door het einde van de gelabelde DNA-fragmenten te breken met basispecifieke chemicaliën. Vandaar dat het bekend staat als chemische sequencing. Sanger sequencing-methode werd geïntroduceerd in 1977 en is gebaseerd op de door ddNTP aangestuurde kettingbeëindigingsreacties. Sanger-sequentiemethode populairder dan de Maxam Gilbert-methode vanwege verschillende nadelen van de Maxam Gilbert-methode zoals buitensporige tijdsbesparing, gebruik van gevaarlijke chemicaliën, enz. Dit is het verschil tussen de sequencing van Maxam Gilbert en Sanger..

Referenties:
1. Maxam, A. M en Walter Gilbert. "Een nieuwe methode voor het sequencen van DNA." Proceedings van de National Academy of Sciences. National Acad Sciences, 9 december 1976. Web. 30 maart 2017
2.Heather, James M. en Benjamin Chain. "De sequentie van sequencers: de geschiedenis van het sequencen van DNA." Genomics. Academic Press, januari 2016. Web. 30 maart 2017
3.Pareek, Chandra Shekhar, Rafal Smoczynski en Andrzej Tretyn. "Sequentingtechnologieën en genoomsequencing." Journal of Applied Genetics. Springer-Verlag, november 2011. Web. 30 maart 2017

Afbeelding met dank aan:
1. "Maxam gilbert sequencing" By Several Times op Engels Wikipedia (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-sequencing" door Estevezj - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia