Verschil tussen NGS en Sanger Sequencing
Share
Sleutelverschil - NGS versus Sanger-reeksen
Next Generation Sequencing (NGS) en Sanger Sequencing zijn twee soorten nucleotide sequencingtechnieken die in de loop van de tijd zijn ontwikkeld. Sanger Sequencing-methode werd vele jaren op grote schaal gebruikt en NGS verving deze recent vanwege zijn voordelen. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger Sequencing is dat NGS werkt volgens het principe van het gelijktijdig sequencen van miljoenen sequenties op een snelle manier door een systeem voor sequentiebepaling, terwijl de Sanger-sequencing werkt op het principe van ketenbeëindiging als gevolg van selectieve incorporatie van dideoxynucleotiden door DNA-polymerase-enzym tijdens de DNA-replicatie en resulterende fragmentscheiding door capillair elektroforese.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is nucleotidesequentie
3. Wat is NGS
4. Wat is Sanger-sequencing
5. Vergelijking zij aan zij - NGS versus Sanger-reeksen
6. Samenvatting
Wat is nucleotidesequentie?
Genetische informatie wordt opgeslagen in de nucleotidesequenties van het DNA of RNA van een organisme. Het proces van het bepalen van de juiste volgorde van nucleotiden (met behulp van vier basen) in een bepaald fragment (in een gen, cluster van genen, chromosoom en compleet genoom) is bekend als nucleotide sequencing. Het is erg belangrijk in genomische studies, forensische studies, virologie, biologische systematiek, medische diagnose, biotechnologie en op veel andere gebieden om de structuur en functie van genen te analyseren. Er zijn verschillende soorten sequentiemethoden ontwikkeld door wetenschappers. Onder hen, Sanger-sequencing ontwikkeld door Frederick Sanger in 1977 werd veel gebruikt en populair voor een lange periode tot Next Generation Sequencing Vervangen.
Wat is NGS?
Next Generation Sequencing (NGS) is een term die wordt gebruikt om te verwijzen naar moderne sequencingprocessen met hoge doorvoer. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequencingtechnologieën die een revolutie teweegbrachten in genomische studies en Molecular Biology. Die technieken zijn Illumina-sequencing, Roche 454-sequencing, Ion Proton-sequencing en SOLiD (sequentiebepaling door Oligo-ligatiedetectie) -sequencing. NGS-systemen zijn sneller en goedkoper. Vier hoofdsequenties voor DNA-sequencing worden gebruikt in NGS-systemen namelijk; pyrosequencing, sequentiebepaling door synthese, bepaling van de sequentie door ligatie en bepaling van de sequentie van de ion-halfgeleider. Van een groot aantal DNA- of RNA-strengen (miljoenen) kan parallel worden gesequenced. Het maakt sequencing van het volledige genoom van organismen binnen een korte tijdsperiode mogelijk, in tegenstelling tot Sanger-sequencing die meer tijd in beslag neemt.
NGS heeft veel voordelen ten opzichte van de conventionele sequentiemethode Sanger. Het is een snel, accurater en kosteneffectiever proces dat met een kleine steekproefomvang kan worden uitgevoerd. NGS kan worden gebruikt in metagenomische studies, in de detectie van variaties binnen een individueel genoom door inserties en deleties, enz. En in de analyse van genexpressies..
Figuur 1: Ontwikkelingen in NGS-sequencing
Wat is Sanger-sequencing?
Sanger Sequencing is een sequentiemethode ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn collega's in 1977 om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Het is ook bekend als ketenbeëindigingssequencing of Dideoxy-reeksen. Het werkingsprincipe van deze methode is de beëindiging van strengsynthese door selectieve incorporatie van een ketenafsluitende dideoxynucleotiden (ddNTP's) zoals ddGTP, ddCTP, ddATP en ddTTP door DNA-polymerase tijdens de replicatie van DNA. Normale nucleotiden hebben 3'-OH-groepen voor de vorming van een fosfodiesterbinding tussen aangrenzende nucleotiden om de strengvorming voort te zetten. Echter, ddNTP's missen deze 3'-OH-groep en zijn niet in staat om fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden te vormen. Vandaar dat de kettingrek wordt gestopt.
In deze methode dient het enkelstrengs DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald als de matrijsstreng in vitro DNA-synthese. Andere vereisten zijn oligonucleotide primer, deoxynucleotide precursors en DNA polymerase enzym. Wanneer de flankerende uiteinden van het doelwitfragment bekend zijn, kunnen primers gemakkelijk worden ontworpen voor DNA-replicatie. Vier afzonderlijke DNA-synthesereacties worden uitgevoerd in vier afzonderlijke buizen. Elke buis heeft afzonderlijke ddNTP's, samen met andere vereisten. Van het specifieke nucleotide wordt een mengsel van dNTP's en ddNTP's toegevoegd. Evenzo worden vier afzonderlijke reacties uitgevoerd in vier buizen met vier mengsels. Na de reacties worden de detectie van DNA-fragmenten en de conversie van het fragmentpatroon in sequentie-informatie uitgevoerd. Resulterende DNA-fragmenten worden door hitte gedenatureerd en gescheiden door gelelektroforese. Als radioactieve nucleotiden worden gebruikt, kan het bandpatroon in de polyacrylamidegel worden gevisualiseerd door middel van autoradiografie. Wanneer deze methode de fluorescent gelabelde dideoxynucleotiden gebruikt, kan deze worden verzacht door de gel die wordt gelezen en door een laserstraal worden gevoerd om door de fluorescentiedetector te worden gedetecteerd. Om fouten te voorkomen die kunnen optreden wanneer een reeks door het oog wordt gelezen en handmatig in een computer wordt ingevoerd, heeft deze methode zich ontwikkeld tot het gebruik van een geautomatiseerde sequencer in combinatie met de computer.
Dit is de methode die wordt gebruikt om DNA van het Human Genome-project te sequensen. Deze methode is nog steeds in gebruik met geavanceerde aanpassingen omdat het nauwkeurige sequentie-informatie geeft, ondanks dat het een duur en traag proces is.
Figure_2: Sanger-sequencing
Wat is het verschil tussen NGS en Sanger Sequencing?
NGS vs Sanger Sequencing | |
| Next Generation Sequencing (NGS) verwijst naar moderne sequencingprocessen met hoge doorvoer. Het beschrijft een aantal verschillende moderne sequencing-technologieën | Sanger Sequencing is een sequentiemethode ontwikkeld door Frederick Sanger om de precieze nucleotidevolgorde van een bepaald DNA-fragment te bepalen. |
| Kosten efficiëntie | |
| NGS is een goedkoper proces omdat het tijd, mensenmacht en chemicaliën vermindert. | Dit is een kostbaar proces omdat het tijd kost, de macht van de mens en meer chemicaliën. |
| Snelheid | |
| Dit is sneller omdat zowel chemische detectie als signaaldetectie van veel strengen parallel plaatsvinden. | Dit is tijdrovend omdat chemische detectie en signaaldetectie gebeurt als twee afzonderlijke processen en alleen op draad tegelijk kan worden gelezen. |
| Betrouwbaarheid | |
| NGS is betrouwbaar. | Sanger-sequencing is minder betrouwbaar |
| Voorbeeldgrootte | |
| NGS vereist minder hoeveelheid DNA. | Voor deze methode is een grote hoeveelheid template-DNA nodig. |
| DNA-basen per gefragmenteerd fragment | |
| Het aantal DNA-basen per gefragmenteerd fragment is lager dan de Sanger-methode | Het genereren van sequenties is langer dan NGS-sequenties. |
Samenvatting - NGS vs Sanger Sequencing
NGS en Sanger Sequencing zijn nucleotide sequencingtechnieken die op grote schaal worden gebruikt in Molecular Biology. Sanger-sequencing is een vroege sequentiemethode die werd vervangen door NGS. Het belangrijkste verschil tussen NGS en Sanger Sequencing is dat NGS een snel, accurater en kosteneffectiever proces is dan Sanger-sequencing. Beide technieken zorgden voor grote uitbraken in de genetica en biotechnologie.
Referentie:
1. Nowrousian, Minou. "Next-Generation Sequencing-technieken voor eukaryote micro-organismen: op sequenties gebaseerde oplossingen voor biologische problemen." Eukaryote cel. American Society for Microbiology, september 2010. Web. 18 feb. 2017
2. Sanger, F., S. Nicklen en A. R. Coulson. "DNA-sequencing met keten-beëindigende remmers." Proceedings van de National Academy of Sciences 74.12 (1977): 5463-467. Web.
3. Liu, Lin, Yinhu Li, Siliang Li, Ni Hu, Yimin He, Ray Pong, Danni Lin, Lihua Lu en Maggie Law. "Vergelijking van Sequencing Systemen van de volgende generatie." Journal of Biomedicine and Biotechnology 2012 (2012): 1-11. Web.
Afbeelding met dank aan:
"Sanger-sequencing" door Estevezj - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
"Ontwikkelingen in de sequencing van de volgende generatie" Door Nederbragt, Lex (2012) - (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia
