Waarom is Taq Polymerase thermostatisch

Taq polymerase is een enzym dat wordt gebruikt in de polymerasekettingreactie (PCR) om DNA te synthetiseren in vitro. Het is analoog aan de E coli DNA-polymerase 1. Het kan hoge temperaturen weerstaan ​​die in PCR worden gebruikt, en behoudt zijn enzymatische activiteit. Taq polymerase wordt van nature aangetroffen in een thermofiele bacterie die bekend staat als Thermus aquaticus. De bacterie leeft in extreem warme omgevingen zoals hydrothermale ventilatieopeningen en warmwaterbronnen. Daarom is het zeer thermostabiel. De optimale temperatuur voor de activiteit van Taq polymerase is 75-80 ° C.

Key Areas Covered

1. Wat is Taq Polymerase
     - Definitie, locatie, eigenschappen
2. Waarom is Taq Polymerase thermostatisch
     - Thermofiele aard van Thermus Aquaticus
3. Wat is de rol van Taq Polymerase in PCR
     - Gebruik van Taq-polymerase in PCR

Sleutelbegrippen: DNA-polymerase 1, PCR, Taq-polymerase, thermofiele bacteriën, Thermus aquaticus

Wat is Taq polymerase

Taq polymerase is een in de handel verkrijgbaar, thermostabiel DNA-polymerase dat in PCR wordt gebruikt om DNA te synthetiseren. Het is afgeleid van de eubacterium genaamd Thermus aquaticus. De natuurlijke habitat van de bacterie is hete thermische bronnen met een omgevingstemperatuur van 70-75 ° C. De structuur van Taq polymerase wordt getoond in Figuur 1.

Figuur 1: Taq-polymerase

Taq polymerase is een 94 kD, DNA-afhankelijk DNA-polymerase, dat homoloog is aan DNA-polymerase 1 inch E coli. Vandaar, Taq polymerase is samengesteld uit een 3'-OH-nucleotide-additieplaats, de dNTP / DNA-bindingsplaats en de 5'-naar-3'-exonucleaseplaats. Het heeft echter geen 3 'tot 5' exonucleasedomein voor het proeflezen van inkomende nucleotiden. 

Waarom is Taq Polymerase thermostatisch

De bacterie waar Taq polymerase dat van nature voorkomt, is thermofiel. Het leeft in omgevingen met extreme temperaturen zoals hydrothermale ventilatieopeningen en warmwaterbronnen. Thermus aquaticus is afgezonderd van de bruisende warmwaterbronnen van het Yellowstone National Park in de VS.. Zoals Thermus aquaticus is aangepast om te leven in de extreme temperaturen, de Taq polymerase dat is geïsoleerd van de bacterie is ook in staat om hogere temperaturen te weerstaan. Warmwaterbronnen van het Yellowstone National Park worden getoond in Figuur 2.

Figuur 2: Grand Prismatic Spring in het Yellowstone National Park

Wat is de rol van Taq Polymerase in PCR

Het Klenow-fragment van DNA-afhankelijk DNA-polymerase 1 werd eerst gebruikt in PCR die niet hittebestendig is. Het ontbrak echter de 5 'tot 3' exonuclease-activiteit. De optimale temperatuur van het Klenow-fragment is 37 ° C. Daarom moest per cyclus een nieuw enzym aan de reactie worden toegevoegd. Het resterende Klenow-fragment werd gedenatureerd tijdens de denaturatiestap van PCR die optreedt bij 95 ° C. Bovendien kon het Klenow-fragment alleen minder dan 400 bp-fragmenten synthetiseren. De stappen van PCR worden getoond in figuur 3.

Figuur 3: PCR
1 - Denaturatie bij 95 ° C, 2 - Gloeien bij 68 ° C, 3 - Verlenging bij 72 ° C, 4 - Voltooiing van een cyclus

Ondertussen ontdekte Thomas D. Brock in 1966 de thermofiel, Thermus aquaticus van de bruisende warmwaterbronnen van het Yellowstone National Park in de VS. Daarna, de Taq polymerase, dat wordt geëxtraheerd uit Thermus aquaticus werd gebruikt in de PCR. Taq polymerase wordt gebruikt om de primers te verlengen door de toevoeging van nucleotiden aan de matrijs tijdens PCR. Tijdens PCR worden de reactanten tot 95 ° C verwarmd. Normaal DNA-polymerase zou door deze hoge temperatuur worden gedenatureerd. De optimale temperatuur voor Taq polymerase is 75-80 ° C. Verder is de foutenmarge van Taq polymerase is ongeveer één op elke miljoen basenparen. pfu is een ander type thermostabiel DNA-polymerase dat wordt gebruikt in plaats van Taq polymerase in PCR. Het beschikt over proeflezen vermogen. Daarom is het nauwkeuriger dan Taq polymerase.

Referentie:

1. "Taq en andere thermostabiele DNA-polymerasen." SpringerLink, Springer, Dordrecht, 1 januari 1970, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Taq" door Adenosine - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Grand Prismatic Spring, Yellowstone National Park (3646969937)" door Frank Kovalchek uit de VS - Grand Prismatic Spring, Yellowstone National Park (CC BY 2.0) via Commons Wikimedia
3. "Pcr" door Magnus Manske (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia