Waarom wordt PCR gebruikt in het proces van DNA-sequencing

DNA-sequencing is een techniek die wordt gebruikt om de nucleotidesequentie van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie zijn twee soorten sequentiemethoden. Fluorescente markers worden gebruikt om elk nucleotide in de sequentie te identificeren. PCR wordt gebruikt voor de opname van de fluorescente markers in het DNA-fragment. PCR (polymerasekettingreactie) is een techniek die in het laboratorium wordt gebruikt om miljoenen kopieën van een bepaald DNA-fragment te produceren. De analyse van de PCR-fragmenten in de gel maakt de bepaling van de nucleotidesequentie van het DNA-fragment mogelijk.

Key Areas Covered

1. Wat is Sequencing
     - Definitie, types van sequencing - next-generation sequencing, Sanger-sequencing
2. Waarom wordt PCR gebruikt in het proces van DNA-sequencing
    - Incorporatie van fluorescente kleurstoffen tijdens PCR

Sleutelbegrippen: ddNTP's, dNTP's, DNA-sequentiëring, fluorescente kleurstoffen, sequencing van de volgende generatie, PCR, Sanger-sequencing

Wat is Sequencing

Sequentiebepaling is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om de nucleotidesequentie van een DNA-molecuul te bepalen. Sanger-sequencing en next-generation sequencing zijn de twee belangrijkste methoden voor DNA-sequencing. Beide DNA-sequencingmethoden zijn betrokken bij de incorporatie van fluorescerende makers in de DNA-streng met PCR voor de bepaling van de nucleotidesequentie van een bepaalde DNA-streng..

Sanger-sequencing

De eerste methode van sequencing, die bekend staat als Sanger-sequencing, is voor het eerst ontwikkeld door Fredric Sanger in 1975. Het is daarom bekend als Sanger-sequencing. Sanger-sequencing is betrokken bij de selectieve incorporatie van keten-terminerende dideoxynucleotiden (ddNTPS) door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-synthese. Daarom is het ook bekend als ketenbeëindigingsmethode. Reguliere deoxynucleotiden (dNTP's) worden gebruikt voor de verlenging van de DNA-streng. ddNTP's worden ook aan het reactiemengsel toegevoegd voor het beëindigen van de ketengroei. De vier typen ddNTP's worden toegevoegd aan vier afzonderlijke PCR-mengsels. Daarom worden vier afzonderlijke PCR-reacties uitgevoerd door toevoeging van ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP. Voor elk reactiemengsel, een enkel type toegevoegd ddNTP (als ddATP wordt toegevoegd), wordt de groei van verschillende amplicons beëindigd bij elk (A) nucleotide in het DNA-fragment. Vervolgens worden de vier reacties gescheiden door middel van gelelektroforese. De emitterende fluorescentie wordt gedetecteerd door een fluorometer. Sanger-sequencing wordt algemeen gebruikt voor het bepalen van de sequentie van de fragmenten die worden gebruikt bij DNA-klonering en de fragmenten geamplificeerd met PCR. De algemene procedure voor Sanger-sequencing wordt weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: Algemeen proces van Sanger-sequencing

Volgende-generatie reeksen

De volgende generatie sequencing is de verzamelnaam voor de meest recente DNA-sequentiebepalingstechnologieën. Verschillende sequencing-reacties worden in micro-schaal op een chip tegelijk uitgevoerd in sequencing van de volgende generatie. Beide sequentiemethoden gebruiken gelabelde nucleotiden met fluorescentie die tijdens PCR in het amplicon zijn geïncorporeerd, hetgeen de bepaling van de nucleotidesequentie mogelijk maakt. Keten beëindigende toevoeging van fluorescente markers is ook betrokken bij de volgende generatie sequencing. Het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie is echter het gebruik van capillaire elektroforese voor de scheiding van verschillend gelabelde amplicons in sequencing van de volgende generatie. Capillaire elektroforese is een analytische scheidingsmethode waarbij de moleculen worden gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit.

Waarom wordt PCR gebruikt in het proces van DNA-sequencing

Tijdens de sequentiebepaling moeten fluorescente markers worden opgenomen in de DNA-streng voor de bepaling van de nucleotidesequentie. Deze opname vindt plaats tijdens PCR. Over het algemeen worden de vier typen dNTP's geïncorporeerd in de nieuw-synthetiserende DNA-streng tijdens PCR. Dit fenomeen wordt gebruikt bij DNA-sequencing om fluorescent-gelabelde dideoxynucleotiden (ddNTP's) in het amplicon op te nemen bij het bepalen van de DNA-sequentie.

Over het algemeen wordt een mengsel van reguliere vier basen (dNTP's; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) aan het PCR-reactiemengsel toegevoegd tijdens DNA-sequencing..

Bovendien wordt een van de vier dideoxynucleotiden (ddNTP's; ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP) toegevoegd als componenten van de PCR-reactie in een lage concentratie. Ten slotte moeten vier PCR-reacties worden uitgevoerd om de volledige sequentie te bepalen. 

Figuur 1: Een bepaalde DNA-sequentie

De ddNTP's missen de 3'-OH-groep waaraan het binnenkomende nucleotide wordt toegevoegd door DNA-polymerase. Vandaar dat de incorporatie van de ddNTP de ketengroei beëindigt. Aldus vindt in elk van de vier PCR-reacties de ketenbeëindiging op een bepaalde basis plaats. Deze ddNTP's worden ook opgenomen met verschillende fluorescente kleurstoffen (De ddATP is gelabeld met groene kleurstof; de ddGTP is gelabeld met gele kleurstof; de ddCTP is gelabeld met blauw, en de ddTTP is gelabeld met rode kleurstof). De opname van de fluorescente kleurstoffen en de ketenbeëindiging vinden plaats tijdens PCR. De amplicons worden op een gel geleid en de gel wordt gescand op de fluorescentie door een fluorometer in de geautomatiseerde sequencer voor de bepaling van de nucleotidesequentie..

Conclusie

DNA-sequencing is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om de nucleotidesequentie van een bepaald DNA-fragment te bepalen. Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie incorporeren verschillende fluorescente kleurstoffen in het DNA-fragment voor de bepaling van de nucleotidesequentie tijdens een PCR.

Referentie:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, hier beschikbaar.
2. "DNA sequencen - Geautomatiseerde reeksen met fluorescerende kleurstoffen." JRank-artikelen, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Sanger-sequencing - algemeen" Автор: Gebruiker: Fibonachi - власна робота (CC BY-SA 1.0) via Commons Wikimedia [modified] 2. "DNA-sequentie" door Sjef - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia