Waarom wordt 16s rRNA gebruikt om bacteriën te identificeren

Bacteriën zijn de meest alomtegenwoordige levensvorm op aarde. De biomassa van bacteriën overtreft die van planten of dieren. Vanwege hun overvloed zijn de meeste bacteriesoorten nog niet geïdentificeerd. De traditionele identificatie van bacteriën is gebaseerd op de fenotypische kenmerken, die niet nauwkeurig zijn als genotypische methoden. De vergelijking van de 16S-rRNA-sequentie is naar voren gekomen als een genotypische methode met de meeste voorkeur voor de identificatie van bacteriën in hun genusniveau. Er zijn verschillende redenen om 16S rRNA te gebruiken als een huishoudelijke genetische maker, welke verder in detail zal worden uitgelegd.

Key Areas Covered

1. Wat is 16S rRNA
     - Definitie, structuur, rol
2. Waarom wordt 16S rRNA gebruikt om bacteriën te identificeren
     - Introductie, Redenen, Methoden
3. Wat zijn de toepassingen van het 16S rRNA in de microbiologie
     - toepassingen

Sleutelbegrippen: bacteriën, classificatie, gensequentie, identificatie, ribosoom, 16S rRNA

Wat is 16S rRNA

Het 16S-rRNA is een component van de kleine subeenheid van het prokaryote ribosoom. De twee subeenheden van het prokaryotische ribosoom zijn 50S grote subeenheid en de 30S kleine subeenheid. Ze vormen 70S-ribosoom. De kleine subeenheid is samengesteld uit 16S-rRNA gebonden aan 21 eiwitten. Het 16S-rRNA bestaat uit 1540 nucleotiden. De secundaire structuur van 16S-rRNA wordt getoond in Figuur 1.

Figuur 1: 16S-rRNA

Het 3'-uiteinde van het 16S-rRNA bevat de anti-Shine-Dalgarno-sequentie die stroomopwaarts bindt aan het startcodon, AUG. De Shine-Dalgarno-sequentie is de ribosomale bindingsplaats van het bacteriële mRNA. Aangezien 16S-rRNA essentieel is voor het functioneren van de bacteriën, is het gen dat codeert voor het 16S-rRNA in hoge mate geconserveerd onder bacteriesoorten. De sequentie van het 16S-rRNA wordt veel gebruikt bij de identificatie en classificatie van bacteriën. 

Waarom wordt 16S rRNA gebruikt om bacteriën te identificeren

De traditionele identificatiemethoden van bacteriën zijn voornamelijk gebaseerd op de fenotypische kenmerken van bacteriën. De vergelijking van de 16S-rRNA-sequentie is echter een 'gouden standaard' geworden, die de traditionele methoden voor bacteriële identificatie vervangt. De analyse van de 16S-rRNA-sequentie is beter voor de identificatie van fenotypisch afwijkende, slecht beschreven of zelden geïsoleerde stammen. Het is ook beter voor de identificatie van niet-gekweekte bacteriën en nieuwe pathogenen. Het 16S-rRNA-gen treedt op in het rRNA-operon in het bacteriële genoom. Het rRNA-operon wordt getoond in Figuur 2.

Figuur 2: rRNA Operon

16S-rRNA is om verschillende redenen geschikt om te worden gebruikt als een genetische marker voor huishoudens. Ze worden hieronder beschreven.

1. 16S-rRNA-gen is een alomtegenwoordig gen in het bacteriële genoom. Omdat de 16S-rRNA-functie essentieel is voor de bacteriële cel tijdens translatie, zijn bijna alle bacteriële genomen samengesteld uit het 16S-rRNA-gen.
2. De sequentie van het 16S-rRNA-gen is in hoge mate geconserveerd. Omdat de functie van het 16S-rRNA algemener is, is de sequentie van het 16S-rRNA-gen in hoge mate geconserveerd. De veranderingen in de gensequentie kunnen worden beschouwd als een maat voor de tijd (evolutie).
3. De grootte van het 16S rRNA-gen (1, 550 bp) is voldoende voor doeleinden van de bioinformatica.
4. 16S-rRNA-gen is een goed bestudeerd gen in het bacteriële genoom. Omdat de functie van het 16S-rRNA-gen van vitaal belang is voor de cel, wordt het onderworpen aan veel studies.

Identificatie

Tot op heden zijn meer dan 8, 168 bacteriesoorten geïdentificeerd met het gebruik van 16S rRNA gensequentie. De procedure voor het identificatieproces wordt hieronder beschreven.

1. Extractie van genomisch DNA
2. PCR-amplificatie van het 16S-rRNA-gen
3. Verkrijg de nucleotidesequentie van het geamplificeerde 16S-rRNA-gen
4. Vergelijk de sequentie met de bestaande nucleotide-sequenties in de databases

De 16S rRNA-sequentie is ongeveer 1, 550 basenparen lang en is samengesteld uit zowel variabele als geconserveerde gebieden. De universele primers, die complementair zijn aan het geconserveerde gebied van het gen, kunnen worden gebruikt voor de amplificatie van het variabele gebied van het gen door middel van PCR. In het algemeen wordt het gebied van 540 basenparen vanaf het begin van het gen of het gehele gen door PCR geamplificeerd. Van het PCR-fragment wordt de sequentie bepaald en de sequentie wordt vergeleken met de bestaande nucleotidesequenties van het 16S-rRNA-gen voor de identificatie van de vooraf geïsoleerde bacteriesoort. GenBank, de grootste opslagplaats voor nucleotidesequenties, heeft meer dan 20 miljoen sequenties van 90.000 verschillende 16S-rRNA-genen. Als de bacteriesoort nieuw is, zal de sequentie niet overeenkomen met enige 16S-rRNA-sequentie in de databases.

Classificatie

Omdat de 16S-rRNA-gensequentie in vrijwel alle bacteriesoorten wordt aangetroffen, kan de vergelijking van verschillende 16S-rRNA-gensequenties worden gebruikt om bacteriën tot soorten- en subspeciesiveaus te differentiëren. Vergelijkbare bacteriesoorten kunnen vergelijkbare sequenties van 16S-rRNA-gen hebben. Een fylogenetische boom van bacteriën geconstrueerd door het vergelijken van de 16S-rRNA-gensequentie wordt getoond in figuur 3.

Figuur 3: Phylogenetische boom geconstrueerd op basis van 16S rRNA-sequentievergelijking

Wat zijn de toepassingen van 16S rRNA in de microbiologie

De toepassingen van het 16S rRNA in de microbiologie zijn hieronder opgesomd.

1. 16S rRNA-gensequencing wordt gebruikt als de "gouden standaard" voor de identificatie en taxonomische classificatie van bacteriesoorten.
2. Vergelijking van de 16S-rRNA-sequentie kan worden gebruikt voor de herkenning van nieuwe pathogenen.
3. De 16S rRNA-sequencing kan worden gebruikt als een snel en goedkoop alternatief voor de fenotypische methoden voor bacteriële identificatie in de medische microbiologie.

Conclusie

Het 16S-rRNA is van vitaal belang voor het functioneren van de bacteriën, omdat het een plaats biedt voor de binding van bacterieel mRNA aan het ribosoom tijdens translatie. Omdat de functie van het 16SrRNA essentieel is voor de cel, is de gensequentie ervan aanwezig in bijna alle bacteriële cellen. Bovendien is de volgorde ervan sterk geconserveerd. De 16S-rRNA-sequentie is echter ook samengesteld uit variabele gebieden, hetgeen de identificatie van bacteriesoorten mogelijk maakt. Bovendien kunnen bacteriesoorten worden geclassificeerd op basis van de gensequentie van 16S-rRNA.

Referentie:

1. Janda, J. Michael en Sharon L. Abbott. "16S rRNA-gensequentiebepaling voor bacteriële identificatie in het diagnostisch laboratorium: pluspunten, gevaren en valkuilen." Journal of Clinical Microbiology, American Society for Microbiology, september 2007, hier beschikbaar.
2. Clarridge, Jill E. "Impact van 16S rRNA gensequentieanalyse voor identificatie van bacteriën op klinische microbiologie en infectieziekten." Clinical Microbiology Reviews, American Society for Microbiology, oktober 2004, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "16S" door Squidonius - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Amit Yadav Phytoplasma rRNA operon" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Fylogenetische positie van moleculen bij bacteriën" door Kenro Oshima, Kensaku Maejima en Shigetou Namba - Front. Microbiol., 14 augustus 2013 / doi: 10.3389 / fmicb.2013.00230 (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia