Differkinome

Wat is het verschil tussen directe en indirecte ELISA

Wetenschap
Share

De grootste verschil tussen directe en indirecte ELISA is dat in directe ELISA is het primaire antilichaam direct geconjugeerd aan het detectie-enzym terwijl in indirecte ELISA een secundair antilichaam dat complementair is aan het primaire antilichaam is geconjugeerd met het detectie-enzym. Dit betekent dat directe ELISA een enkel antilichaam gebruikt, terwijl indirecte ELISA twee antilichamen gebruikt.

Directe en indirecte ELISA zijn twee ELISA-methoden (enzymgebonden immunosorbenttest) die worden gebruikt om de aanwezigheid van een specifiek antigeen of antilichaam in het medium te detecteren.

Key Areas Covered

1. Wat is directe ELISA
     - Definitie, procedure, kenmerken
2. Wat is indirecte ELISA
     - Definitie, procedure, kenmerken
3. Wat zijn de overeenkomsten tussen directe en indirecte ELISA
     - Overzicht van gemeenschappelijke functies
4. Wat is het verschil tussen directe en indirecte ELISA
     - Vergelijking van belangrijke verschillen

Sleutelbegrippen

Directe ELISA, detectie-enzym, indirecte ELISA, primair antilichaam, secundair antilichaam, substraat

Wat is directe ELISA

Directe ELISA is een ELISA-methode die de detectie van het antigeen met een enzymgebonden primair antilichaam zelf mogelijk maakt. Deze ELISA-methode werd voor het eerst ontwikkeld door Perlmann en Engvall. Het wordt beschouwd als de eenvoudigste vorm van ELISA. De stappen van directe ELISA worden hieronder vermeld:

  1. Coating van het oppervlak van de plaat met het monster;
  2. Incubatie van de plaat met het enzym-geconjugeerde, primaire antilichaam;
  3. Wassen voor het verwijderen van ongebonden antilichamen van de plaat;
  4. Toevoeging van het substraat vereist door de enzymatische reactie;
  5. Detectie van de signalen geproduceerd uit de plaat.

Hier zijn de twee hoofdtypen van enzymen geconjugeerd met het primaire antilichaam HRP (mierikswortelperoxidase) en alkalische fosfatase. De drie typen substraten die samen met de HRP worden gebruikt, zijn OPD (o-fenyleendiaminedihydrochloride), TMB (3, 3 ', 5, 5'-tetramethylbenzidine) en ABTS (2, 2'-Azinobis [3-ethylbenzothiazoline-6- sulfonzuur] -diammoniumzout). Het substraat dat samen met het alkalische fosfatase wordt gebruikt, is PNPP (p-nitrofenylfosfaat, dinatriumzout). De enzymatische reactie op het substraat veroorzaakt een kleurverandering in het medium, hetgeen afhangt van het type substraat en het enzym dat voor de reactie wordt gebruikt. Dit vergemakkelijkt de detectie van monsters met het doelantigeen. 

Figuur 1: Directe ELISA

Directe ELISA is meer geschikt voor de detectie van de hoeveelheid antigeen met hoog molecuulgewicht in een monster. Het minder aantal stappen in deze ELISA-methode maakt het een snellere test. Vanwege de kosten en de tijd die is geïncorporeerd in de labeling van het primaire antilichaam met enzymen, is het gebruik van directe ELISA echter vrij zeldzaam. Aan de andere kant produceert het eveneens nadelige effecten op het doelantigeen.

Wat is indirecte ELISA

Indirecte ELISA is een andere ELISA-methode die twee antilichamen gebruikt voor de detectie: primair en secundair antilichaam. De stappen van de indirecte ELISA zijn als volgt:

  1. Coating van het oppervlak van de plaat met het monster;
  2. Incubatie van de plaat met het primaire antilichaam;
  3. Wassen om de ongebonden antilichamen van de plaat te verwijderen;
  4. Incubatie van de plaat met het secundaire antilichaam geconjugeerd met het detectie-enzym;
  5. Wassen om de ongebonden antilichamen van de plaat te verwijderen;
  6. Toevoeging van het substraat vereist door de enzymatische reactie;
  7. Detectie van de signalen geproduceerd uit de plaat.

    Figuur 2: Indirecte ELISA

Indirecte ELISA verloopt via twee antilichaam-bindende stappen. Aan de andere kant is het secundaire antilichaam geconjugeerd met het detectie-enzym. Over het algemeen zijn er veel secundaire antilichamen geconjugeerd met enzymen. Hier is het secundaire antilichaam in hoofdzaak een polyklonaal, anti-species antilichaam. Vanwege de beschikbaarheid van aan enzymen geconjugeerde antilichamen, wordt de indirecte ELISA-methode vaker gebruikt in immunologische testen bij de detectie van parasieten, bacteriën en virussen. Aan de andere kant kunnen verschillende secundaire antilichamen aan het primaire antilichaam in de plaat worden gebonden. Daarom is de gevoeligheid van de test erg hoog.

Overeenkomsten tussen directe en indirecte ELISA

  • Directe en indirecte ELISA zijn twee ELISA-methoden waarbij het betreffende antigeen rechtstreeks aan de plaat is gehecht.
  • Beide methoden omvatten de detectie van de aanwezigheid van een specifiek eiwitmolecuul in een monster. Dit eiwitmolecuul is direct aan de plaat gehecht.
  • 96-well platen of 8-well stripbuizen worden in beide methoden gebruikt. Beide platen en buizen zijn gemaakt van polystyreen. De platen met 96 putjes bieden voldoende ruimte voor de bepaling van de optimale verdunning voor de reactie. Ondertussen zijn 8-wells stripbuizen beter voor de fijn afgestemde assays.

Verschil tussen directe en indirecte ELISA

Definitie

Directe Elisa verwijst naar een type ELISA waarbij het primaire antilichaam is geconjugeerd met het detectie-enzym terwijl indirecte ELISA verwijst naar een type ELISA waarbij het secundaire antilichaam is geconjugeerd met het detectie-enzym..

Aantal gebruikte antilichamen

Directe ELISA gebruikt één antilichaam, dat het primaire antilichaam is, terwijl indirecte ELISA twee antilichamen, primair en het secundaire antilichaam gebruikt. Dit is het belangrijkste verschil tussen directe en indirecte ELISA.

Detectie Enzym is gekoppeld aan

Bovendien is het detectie-enzym gekoppeld aan het primaire antilichaam in directe ELISA terwijl het detectie-enzym is gekoppeld aan het secundaire antilichaam in indirecte ELISA..

Intensiteit van signalen

Een ander verschil tussen directe en indirecte ELISA is dat de signalen die worden geproduceerd door directe ELISA minder intensief zijn terwijl de signalen die worden geproduceerd door indirecte ELISA intensiever zijn vanwege de signaalamplificatie.

Achtergrondsignalen

De directe ELISA produceert echter meer achtergrondsignalen dan de indirecte ELISA.

Gevoeligheid

Directe ELISA is minder gevoelig, terwijl indirecte ELISA gevoeliger is. Dit is ook een verschil tussen directe en indirecte ELISA. 

Kruisreactiviteit

Nog een ander verschil tussen directe en indirecte ELISA is de kruisreactiviteit. Dat wil zeggen dat de kruislingse reactiviteit minimaal is in directe ELISA terwijl deze significant is in indirecte ELISA.

Tijd

Bovendien is directe ELISA minder tijdrovend vanwege minder stappen, terwijl indirecte ELISA meer tijdrovend is vanwege de verdubbelde antilichaambindingsstappen.

Gebruiksfrequentie

Hoewel directe ELISA relatief zeldzaam is, komt indirecte ELISA vaker voor.

Conclusie

Directe ELISA gebruikt alleen het primaire antilichaam voor de detectie van een specifiek antigeen. Dit betekent dat het primaire antilichaam is geconjugeerd met het detectie-enzym in directe ELISA. Maar indirecte ELISA gebruikt een primair antilichaam om aan het antigeen te binden terwijl het aan enzymen geconjugeerde secundaire antilichaam aan het primaire antilichaam bindt. Directe ELISA is minder gebruikelijk vanwege de minder beschikbaarheid van aan enzym geconjugeerd primair antilichaam. Het belangrijkste verschil tussen directe en indirecte ELISA is het aantal gebruikte antilichamen.

Referentie:

1. "Soorten ELISA." Bio-Rad, Bio-Rad Laboratoria, hier beschikbaar

Afbeelding met dank aan:

1. "ELISA-diagram" door Cavitri - Eigen werk (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia  
2. "Indirect ELISA" door Cawang - Eigen werk (CC0) via Commons Wikimedia  

Wetenschap
×