Hoe mRNA te isoleren van totaal RNA

De oligo-dT / drager-combinaties worden hoofdzakelijk gebruikt bij de zuivering van mRNA uit totaal RNA met behulp van een techniek die bekend staat als affiniteitschromatografie. Er zijn twee hoofdmethoden om mRNA te isoleren van totaal RNA op basis van het type cellen; namelijk, directe methode van mRNA-isolatie en minieme methode van mRNA-isolatie. Beide methoden worden in dit artikel uitgelegd.

Messenger RNA (mRNA) is een product van transcriptie, dat bestaat uit een reeks RNA-nucleotiden. Het draagt informatie in genen van de kern tot het cytoplasma voor de synthese van eiwitten. RNA-isolatie van een bepaalde cellijn resulteert in totaal RNA, dat bestaat uit rRNA's en tRNA's samen met mRNA's. Vandaar dat mRNA moet worden gescheiden van het mengsel van totaal RNA tijdens de studie van het transcriptoom van de cellijn. Unieke eigenschappen van mRNA zoals de aanwezigheid van een poly (A) -staart aan het 3'-uiteinde van het mRNA-molecuul worden voor de scheiding gebruikt. Omdat oligo-dT-moleculen complementair zijn aan de poly (A) -staart, kan mRNA worden geïsoleerd uit een mengsel van totaal RNA.

Key Areas Covered

1. Wat is mRNA
- Definitie, structuur, functie
2. Wat is de samenstelling van totaal RNA
- mRNA, rRNA, tRNA
3. Hoe mRNA te isoleren van totaal RNA
- Gebruik van Oligo-dT / dragersmoleculen

Sleutelbegrippen: affiniteitschromatografie, Messenger RNA (mRNA), minusmethode, Oligo dT, poly (A) -staart, totaal RNA

Wat is mRNA

Het mRNA is een transcript van een eiwit coderend gen. Het wordt geproduceerd in de kern in eukaryoten en draagt informatie voor de productie van een bepaald eiwit in het cytoplasma. Het wordt tijdens translatie vertaald in een aminozuursequentie van het eiwit, bijgestaan door ribosomen. Het primaire transcript dat wordt geproduceerd door transcriptie van eukaryoten wordt het pre-mRNA genoemd.

Figuur 1: mRNA-structuur

Tijdens post-transcriptionele modificaties wordt een volwassen mRNA-molecuul geproduceerd met verschillende kenmerken zoals 5'-dop en poly (A) -staart. Het totale mRNA van een bepaald organisme is bekend als zijn transcriptoom.

Wat is de samenstelling van totaal RNA

Het resultaat van RNA-isolatie wordt het totale RNA genoemd. Het is samengesteld uit de drie belangrijkste soorten RNA die door een cel worden geproduceerd. Ze zijn mRNA, tRNA en rRNA. Zowel tRNA als rRNA helpen bij de vertaling. De grootte van eukaryotisch mRNA is 0,5-20 kb. Transfer RNA (tRNA) brengt overeenkomstige aminozuren tijdens translatie. Het is 76-90 basenparen lang en bestaat uit een anticodon-regio, die complementair is aan een bepaald codon op mRNA. Ribosomaal RNA (rRNA) is een bestanddeel van ribosomen. Sommige van de menselijke rRNA's zijn 5 kb lang.

Meer dan 90% van het totale RNA bestaat uit tRNA en rRNA. Slechts 1-5% van totaal RNA is mRNA. Een typische zoogdiercel kan bestaan uit ongeveer 500.000 mRNA-moleculen per cel. De hoeveelheid van een bepaald type mRNA kan 15-20.000 kopieën per cel zijn.

Hoe mRNA te isoleren van totaal RNA

Een aantal moleculaire biologie technieken zoals cDNA bibliotheekconstructie, monstervoorbereiding voor microarray preparaat, Northern blot analyse voor zwak tot expressie gebrachte genen, etc. vereisen hoogwaardig mRNA. Er zijn twee hoofdmethoden om mRNA te isoleren van totaal RNA op basis van het type cellen: directe methode van mRNA-isolatie en minieme methode van mRNA-isolatie.

Directe methode van mRNA-isolatie

Het principe van de scheiding van volwassen mRNA van eukaryoot totaal RNA omvat de affiniteitsselectie / affiniteitschromatografie van gepolyadenyleerd mRNA met het gebruik van oligo dT (oligodeoxthymidylaat), dat complementair is aan de poly (A) -staart. Het wordt mogelijk gemaakt door de afwezigheid van een poly (A) -staart in de twee andere soorten RNA: tRNA en rRNA.

mRNA bestaat uit 30 - 200 adenine-nucleotiden in zijn poly (A) -staart. Affiniteitkolommen gevuld met oligo-dT / drager-combinatie worden gebruikt bij de isolatie van mRNA uit totaal RNA. De oligo-dT / drager-combinatie kan hetzij cellulosegebonden oligo-dT, gebiotinyleerde oligo-dT met aan streptavidine gekoppelde magnetische korrels of oligo-dT-gekoppelde polystyreen-latexkorrels zijn. Alle experimentele condities zouden in RNase-vrije condities moeten zijn om de enzymatische afbraak van RNA te voorkomen.

Figuur 2: Affiniteitschromatografie

Totaal RNA zou moeten worden opgelost in een hoge zoutbuffer en kort worden verwarmd tot 65-70 ° C om secundaire RNA-structuren te verbreken. De voorwaarden voor de isolatie van RNA variëren tussen in de handel verkrijgbare kits voor isolatie van mRNA. De bereiding van poly (A) -RNA of mRNA bestaat echter uit drie stappen.

Hybridisatie van poly (A) -RNA aan oligo dT-moleculen verbonden met een drager
Afwassen van ongebonden RNA
Elutie van poly (A) -RNA uit de combinatie oligo-dT / drager onder omstandigheden van lage stringentie

Minieme methode van mRNA-isolatie

Oligo dT-gebaseerde zuivering van mRNA levert alleen mRNA op met een poly (A) -staart of volgroeid eukaryoot mRNA. Vandaar dat een andere methode die bekend staat als min-methode kan worden gebruikt bij de zuivering van mRNA die geen poly (A) -staart hebben. Deze methode kan worden gebruikt bij de isolatie van mRNA van gist en bacterieel totaal RNA. Het kan ook worden gebruikt bij de isolatie van onrijpe mRNA-typen samen met het rijpe mRNA uit eukaryotische cellen. Het omvat de transcriptoomverrijking door het afbreken van groot ribosomaal RNA uit totaal RNA. De RiboMinus^TM Transcriptome Isolation Kit van ThermoFisher Scientific gebruikt drie stappen in de efficiënte zuivering van mRNA van gist en totaal RNA van bacteriën.

Hybridisatie van totaal RNA met rRNA-sequentiespecifieke 5'-biotine-gelabelde oligonucleotidesondes
Verwijdering van rRNA / 5'-biotine-gelabeld probe-complex samen met de met streptavidine gecoate magnetische korrels
Zuivering van onzuiverheden en elutie van mRNA.

Conclusie

Totaal RNA bestaat uit de drie belangrijkste soorten RNA: mRNA, rRNA en tRNA. Zuivering van mRNA uit totaal RNA is essentieel voor de analyse van het transcriptoom van een bepaald organisme. De werkwijzen voor zuivering zijn gebaseerd op het type mRNA. Eukaryoot mRNA, dat een poly (A) -staart bevat, kan worden geïsoleerd door affiniteitschromatografie met oligo dT. Onvolgroeid eukaryotisch mRNA en mRNA uit gist en bacteriecellen kunnen worden geïsoleerd door groot rRNA uit totaal RNA te verwijderen..

Referentie:

1. "mRNA-extractie." Thermo Fisher Scientific, hier beschikbaar.
2. "RNA-extractie door RNA-type." Thermo Fisher Scientific, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Mature mRNA" (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Affinity" door Jamit op Engelse Wikibooks - Overgezet van en.wikibooks naar Commons door Adrignola met CommonsHelper (Public Domain) via Commons Wikimedia

Wetenschap