Hoe werkt Illumina-reeksen

Illumina-sequencing is een sequentiemethode van de volgende generatie, die ook de "sequentiebepaling-door-synthese"Methode. Illumina-sequencing is betrokken bij de parallelverwerking van miljoenen fragmenten. De vier basisstappen voor de Illumina-sequencingworkflow zijn bibliotheekvoorbereiding, clustergeneratie, sequencing en gegevensanalyse, die in dit artikel verder worden beschreven.

Key Areas Covered

1. Wat is Illumina Sequencing
     - Definitie, feiten, voordelen
2. Hoe werkt Illumina-reeksen
     - Proces van Illumina Sequencing:
          - Bibliotheek voorbereiding
          - Cluster Generation
          - sequencing
          - Gegevensanalyse

Sleutelbegrippen: Cluster Generation, Data Analysis, Illumina Sequencing, Library Preparation, Sequencing by Synthesis

Wat is Illumina Sequencing

Illumina Sequencing of sequencing-by-synthese (SBS) -technologie is de meest gebruikte sequentietechnologie van de volgende generatie ter wereld. Meer dan 90% van de sequentiedata van de wereld worden gegenereerd door Illumina-sequencing. Het werd oorspronkelijk ontwikkeld door Shankar Balasubramanian en David Klenerman aan de Universiteit van Cambridge. Ze richtten in 1998 een bedrijf op dat bekend staat als Solexa. Toen kocht Illumina Solexa in 2007, waardoor de originele technologie snel werd verbeterd. Vandaar dat de methode ook wordt genoemd Solexa / Illumina-sequentiemethode. Het grote voordeel van Illumina-sequencing is dat het een hoge opbrengst aan foutloze lezingen levert.

Hoe werkt Illumina-reeksen

De vier stappen die betrokken zijn bij Illumina-sequencing worden hieronder beschreven.

Stap 1. Bibliotheekvoorbereiding

• Een sequentiebepalingsbibliotheek wordt simultaan voorbereid tagmentation van DNA in korte segmenten van 200-600 basenparen door transposasen in een proces dat bekend staat als tagmentatie, gevolgd door ligatie van adapter in beide 3'- en 5'-uiteinden van de korte DNA-segmenten.
• Aanvullende motieven zoals sequentie primerbindingsplaats, index en een gebied dat complementair is aan stroomceloligo worden aan beide zijden aan de adapter toegevoegd door verminderde cyclus versterking. Tagmentatie en toevoeging van motieven worden getoond in Figuur 1.

Figuur 1: Tagmentatie en toevoeging van motieven

Stap 2. Cluster genereren

• De voorbereide sequentiebepalingsbibliotheek wordt gedenatureerd en in a geladen stroomcel voor het genereren van clusters. Tijdens het genereren van clusters wordt elk fragment in de sequentiebepalingsbibliotheek isothermisch geamplificeerd. De stroomcel bestaat uit glas dat rijstroken bevat. Elke rij is bekleed met twee soorten oligonucleotiden. Eén type is complementair aan het 5'-gebied van de aanvullende motieven en het andere type is complementair aan het 3'-gebied van de aanvullende motieven van de bereide bibliotheek. Derhalve binden deze oligo's aan de overeenkomstige gebieden van DNA in de sequentiebepalingsbibliotheek. De flowcel met twee soorten oligo's wordt getoond in Figuur 2. De oligo die aan het 5'-gebied van de sequentiebepalingsbibliotheek bindt, heeft een roze kleur, terwijl de oligo die aan het 3'-gebied van de sequentiebepalingsbibliotheek bindt groen van kleur is..

Figuur 2: Doorstroomcel

• Zodra de enkelstrengige sequentiebepalingsbibliotheek aan de oligo is gebonden, wordt de complementaire streng door DNA-polymerase gegenereerd. Vervolgens wordt het resulterende dubbelstrengige DNA gedenatureerd en wordt de oorspronkelijke streng weggewassen.
• De klonale versterking van het fragment wordt bereikt door brugversterking. Tijdens dit proces vouwt de streng over het tweede type oligo op de stroomcel. Polymerase synthetiseert vervolgens de dubbelstrengige brug. De denaturatie van de brug resulteert in twee DNA-strengen: zowel voorwaartse als achterwaartse streng op de oligo's van de stroomcel.
• Brugversterking wordt steeds opnieuw herhaald om tegelijkertijd miljoenen clusters van alle soorten fragmenten in de sequentiebepalingsbibliotheek door klonale amplificatie te verkrijgen. Klonale amplificatie wordt getoond in figuur 3.

Figuur 3: Klonale amplificatie

• Vervolgens worden de omgekeerde strengen weggespoeld, waarbij alleen de voorste strengen op de stroomcel worden gehouden. In de voorwaartse streng is het 3'-uiteinde vrij en wordt het geblokkeerd om ongewenste priming te voorkomen.

Stap 3. Sequencing

Eerste lezing van de omgekeerde volgorde

• Sequencing begint met de verlenging van de eerste sequentiebepalingprimer. De Illumina-sequencingmethode maakt gebruik van gemodificeerde dNTP's, die een terminator bevatten op de 3'-positie van de deoxyribosesuiker. Deze dNTP's zijn ook fluorescent gelabeld in verschillende kleuren.

• Na de toevoeging van elk complementair nucleotide worden de clusters in de stroomcel waargenomen voor de emissie van fluorescentie.

• Na de detectie van licht kan de fluorofoor worden afgewassen.

• Vervolgens wordt de terminatorgroep van de 3 'positie van de suiker geregenereerd door een hydroxylgroep, waardoor de toevoeging van een tweede dNTP aan de groeiende keten mogelijk wordt. Dit proces staat bekend als sequencing-by-synthesis. De sequentie-door-synthese wordt getoond in figuur 4.

Figuur 4: Sequencing-by-Synthesis

• Aan het einde van de synthese, de lees eerst de omgekeerde volgorde wordt verkregen en het sequentieproduct wordt weggewassen.

Index 1 Lezen

• De index 1-primer wordt vervolgens gehybridiseerd tot clusters om op dezelfde manier een tweede aflezing op te wekken door sequencing-by-synthese. Het sequentieproduct wordt weggewassen.

Index 2 lezen

• Het 3'-uiteinde van het cluster wordt vervolgens van bescherming ontdaan, waardoor de hybridisatie van het 3'-uiteinde met het tweede type oligo op de stroomcel (groene kleur) mogelijk wordt gemaakt. Hierdoor wordt de volgorde van het index 2-gebied verkregen. Het sequentieproduct wordt weggewassen.

Tweede Lees van de Forward Sequence

• Het tweede type oligo wordt uitgebreid met een polymerase, waardoor een brug met dubbele strengen wordt gevormd. De brug is gedenatureerd en hun 3'-uiteinden zijn geblokkeerd. De voorste draad is weggespoeld.
• De tweede lezing van de voorwaartse sequentie wordt verkregen door sequencing-by-synthese door de hybridisatie en verlenging van de tweede sequentiebepalingsprimer.

Stap 4. Gegevensanalyse

• De miljarden reads verkregen door sequencing zijn gegroepeerd op basis van hun indexsequenties.
• Vervolgens worden de reeksen met soortgelijke waarden geclusterd.
• Vooruit en achteruit lezen worden gepaard om aangrenzende reeksen te vormen.
• De ambigue uitlijningen kunnen worden opgelost door gepaarde sequenties.
• De aaneengesloten sequenties zijn uitgelijnd met het referentiegenoom voor variantidentificatie.

De volgende video legt het complete proces van Illumina-sequencing uit.

Conclusie

Illumina-sequencing is een sequentiemethode van de volgende generatie. Illumina-sequencing is betrokken bij de bereiding van een sequentiebepalingsbibliotheek met 200-600 basenparen lange fragmenten van DNA. De vier stappen die betrokken zijn bij de Illumina-sequencing zijn bibliotheekvoorbereiding, clustergeneratie, sequentiebepaling en gegevensanalyse. Omdat Illumina-sequentiëring sequentielezingen geeft met hoge nauwkeurigheid, is het de veelgebruikte sequentiemethode ter wereld.

Referentie:

1. "Sequencing by Synthesis (SBS) technologie." Sequencing-technologie | Sequentiebepaling door synthese, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "Voorbereiding DNA-verwerking" door DMLapato - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Oligonucleotide-ketens in Flow Cell" door DMLapato - Eigen werk, (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. "Sequencing by synthesis Reversible terminators" By Abizar Lakdawalla (talk) - Ik heb dit werk geheel zelf gecreëerd (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
4. "Cluster Generation" door DMLapato - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia