Hoe werkt DNA-sequentiebepaling

Sequentiebepaling is het proces dat betrokken is bij de bepaling van een nucleotidesequentie van een bepaald DNA-fragment. Tijdens sequentiebepaling wordt het DNA-fragment terminaal gemerkt met fluorescentie-gelabelde nucleotiden door PCR. Dit proces maakt gebruik van vier typen met fluorescentie gelabelde nucleotiden en het zijn dideoxynucleotiden (ddNTP's). ddNTP's missen een 3'-OH-groep waaraan de fosfaatgroep van het binnenkomende nucleotide is gehecht. Daarom zal er, wanneer een ddNTP aan de groeiende keten wordt toegevoegd, geen verdere toevoeging van nucleotiden aan het 3'-uiteinde van de keten plaatsvinden. Dat betekent dat de toevoeging van een ddNTP in de groeiende keten de kettinggroei beëindigt. Omdat ddNTP's in lage concentraties aan het PCR-mengsel worden toegevoegd, wordt elke groeiende keten op verschillende niveaus beëindigd. De emitterende fluorescentie wordt gedetecteerd om de nucleotidesequentie van het DNA-fragment aan het einde van de PCR te bepalen.

Key Areas Covered

1. Wat is DNA-sequentiebepaling
     - Definitie, typen
2. Hoe werkt DNA-sequentiebepaling
     - Proces van DNA-sequencing

Sleutelbegrippen: Dideoxynucleotiden (ddNTP's), Fluorescentie Marker, Gelelektroforese, Next-Generation Sequencing, Nucleotide Sequence, PCR, Sanger Sequencing

Wat is DNA-sequentiebepaling 

DNA-sequencing is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt bij de bepaling van de nucleotidesequentie van een bepaald DNA-molecuul. Het maakt gebruik van fluorescentie-gelabelde nucleotiden, die worden opgenomen tijdens PCR. Er zijn twee hoofdmethoden voor sequencing op basis van de technieken die worden gebruikt bij de detectie van fluorescentie: Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie.

Sanger-sequencing

Sanger-sequencing, ontwikkeld door Fredric Sanger in 1975, is de eerste ontwikkelde sequentiemethode. Het is ook bekend als ketenbeëindigingsmethode sinds het is betrokken bij de selectieve opname van ketenbeëindigende ddNTP's tijdens in vitro DNA-synthese. Bij Sanger-sequencing worden amplicons gescheiden door middel van gelelektroforese. Sanger-sequencing wordt algemeen gebruikt voor de bepaling van de sequentie van de DNA-fragmenten die worden gebruikt bij klonen en de fragmenten geamplificeerd met PCR. Een bepaalde DNA-sequentie wordt getoond in Figuur 1.

Figuur 1: DNA-sequentiebepaling

Volgende generatie sequencing

De meest recente technieken voor het bepalen van DNA-sequenties zijn gezamenlijk bekend als sequencing van de volgende generatie. Het is ook een kettingbeëindigingsmethode. De volgende generatie sequencing maakt gebruik van capillaire elektroforese voor de scheiding van amplicons met verschillende lengten die worden gecreëerd door de kettingbeëindigingsmethode. Sequentiebepaling van de volgende generatie wordt gebruikt bij de bepaling van een groot aantal nucleotiden per run, zoals bij sequentiebepaling van het genoom.

Hoe werkt DNA-sequentiebepaling

Tijdens DNA-sequencing worden fluorescentie-gelabelde nucleotiden door PCR aan een bepaald DNA-fragment toegevoegd. Voor de verlenging van de DNA-streng worden reguliere deoxynucleotiden (dNTP's) gebruikt. DdNTP's worden echter aan het reactiemengsel toegevoegd, dat met fluorescentie is gemerkt. Omdat ddNTP's geen 3'-OH-groep in het deoxyribosesuikermolecuul hebben, kan verdere ketengroei niet optreden, wat de ketengroei beëindigt. Suiker-fosfaat ruggengraat van DNA wordt gevormd door de vorming van fosfodiesterbindingen tussen de 3'-OH-groep van de deoxyribosesuiker en fosfaatgroep van het binnenkomende nucleotide. DdNTP's worden echter in lage concentraties toegevoegd; daarom beëindigen ze niet de kettinggroei tegelijk.

Vier soorten ddNTP's worden toegevoegd aan vier afzonderlijke PCR-mengsels. Vier afzonderlijke PCR-reacties worden uitgevoerd door toevoeging van ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP. Daarom wordt in elk reactiemengsel de ketengroei beëindigd bij respectievelijk A, G, C en T nucleotiden. Als een voorbeeld wordt in het reactiemengsel met toegevoegd ddATP de groei van verschillende amplicons beëindigd bij elk A-nucleotide in het DNA-fragment. Bepaling van de DNA-sequentie door Sanger-sequencing wordt weergegeven in Figuur 2.

Figuur 2: Sanger-sequencing

Elk van de vier typen nucleotiden worden gelabeld door afzonderlijke fluorescentiekleuren; de ddATP is gelabeld met groene kleurstof; de ddGTP is gelabeld met gele kleurstof; de ddCTP is gelabeld met blauw; de ddTTP is gelabeld met rode kleurstof. Daarom zijn de amplicons van de vier PCR-reacties gelabeld in afzonderlijke kleuren.

Na de amplificatie van het geïnteresseerde DNA-fragment worden de amplicons gescheiden door middel van gelelektroforese of capillaire elektroforese. De nucleotidensequentie van het DNA-fragment kan worden bepaald door de detectie van de emitterende fluorescentie. De nucleotidesequentie van 750-1.000 basenparen lange fragmenten kan gemakkelijk worden bepaald per run door Sanger-sequencing. De bepaling van de nucleotidesequentie van een volledig genoom blijft echter voor de hand liggende vanwege een groot aantal nucleotiden in genomen. Volgende sequentietechnieken van de volgende generatie, zoals 454-sequencing, kunnen echter ongeveer 20 miljoen basenparen per enkele run worden gelezen.

Conclusie

DNA-sequencing is een moleculaire biologische techniek die wordt gebruikt bij de bepaling van de nucleotidesequentie van DNA-fragmenten. Tijdens sequentiebepaling worden met fluorescentie gemerkte nucleotiden aan de DNA-fragmenten toegevoegd. Door de emitterende fluorescentie te detecteren, kan de nucleotidesequentie worden bepaald.

Referentie:

1. "DNA-sequencing." Khan Academy, Beschikbaar Hier.

Afbeelding met dank aan:

1. "DNA-sequentie" door Sjef - Eigen werk, Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Didesoxy-Methode" door Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia