Hoe werkt capillaire elektroforese

Capillaire elektroforese (CE) is een analytische scheidingsmethode die een elektrisch veld gebruikt om de componenten van een mengsel van elkaar te scheiden. Kort gezegd is het elektroforese in een capillair, een nauwe buis. Daarom worden de componenten van het mengsel gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit. De drie factoren die de elektroforetische mobiliteit van een bepaald molecuul bepalen, zijn de lading van het molecuul, de viscositeit van het scheidingsmedium en de straal van het molecuul. Alleen de ionen worden beïnvloed door het elektrische veld terwijl de neutrale soorten onaangetast blijven. De snelheid van een molecuul dat door de capillair beweegt, hangt af van de sterkte van het elektrische veld.

Key Areas Covered

1. Wat is capillaire elektroforese
     - Definitie, instrumentatie, methoden
2. Hoe werkt capillaire elektroforese
     - Theorie van capillaire elektroforese

Sleutelbegrippen: capillaire elektroforese (CE), capillaire elektroforetische scheidingsmethoden, capillaire buis, lading, elektro-osmotische stroom elektroforetische mobiliteit

Wat is capillaire elektroforese

Capillaire elektroforese verwijst naar een analytische scheidingsmethode waarbij de componenten van een mengsel worden gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit. In vroege experimenten werd een glazen U-buis gevuld met gels of oplossingen gebruikt. Haarvaten werden na de jaren zestig gebruikt.

Instrumentatie

Het capillair bestaat uit gesmolten silica, met een binnendiameter van 20-100 μm. Een elektrisch veld met hoge spanning wordt aan de uiteinden van de capillaire buis toegevoerd. De elektroden zijn verbonden met de uiteinden van de capillaire buis via een elektrolytoplossing of waterige buffer. Het capillair is gevuld met een geleidende vloeistof bij een bepaalde pH. Naast detectoren en andere uitvoerapparaten worden sommige instrumenten gebruikt voor de temperatuurregeling van het systeem, wat reproduceerbare resultaten oplevert. Het monster wordt geïnjecteerd in de capillair. De instrumentatie van capillair elektroforetisch systeem is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: Capillaire elektroforese - instrumentatie

Methoden voor capillaire elektroforetische scheiding 

Zes soorten capillaire elektroforetische scheidingsmethoden kunnen worden geïdentificeerd.

1. Capillaire zone elektroforese (CZE) - Een vrije oplossing wordt gebruikt als de geleidende vloeistof.
2. Capillaire gelelektroforese (CGE) - Een gel wordt gebruikt als de geleidende vloeistof.
3. Micellaire elektrokinetische capillaire chromatografie (MEKC) - De componenten van een mengsel worden gescheiden door verdeling tussen micellen en het oplosmiddel / geleidende fluïdum.
4. Capillaire elektrochromatografie (CEC) - Een gepakte kolom wordt gebruikt in uitzondering van de geleidende vloeistof. Een mobiele vloeistof wordt samen met het te scheiden mengsel over de kolom gevoerd.
5. Capillaire iso-elektrische focussering (CIEF) - Hoofdzakelijk gebruikt om zwitterionische componenten, zoals peptiden en eiwitten die zowel positieve als negatieve ladingen bevatten, te scheiden. Een geleidende vloeistof met een pH-gradiënt wordt gebruikt om de eiwitoplossing te scheiden. Elk eiwit migreert naar het gebied met zijn iso-elektrisch punt binnen de pH-gradiënt. Op het iso-elektrische punt wordt de netto lading van eiwitten nul.
6. Capillaire isotachoforese (CITP) - Het is een discontinu systeem. Elke component migreert in opeenvolgende zones en de hoeveelheid van de component wordt verkregen door de lengte van de migratie te meten.

Hoe werkt capillaire elektroforese

Over het algemeen beginnen de geladen soorten te bewegen in elektrische velden. De lading, viscositeit en moleculaire straal zijn de drie factoren die de elektroforetische mobiliteit van een molecuul in een elektrisch veld bepalen.

1. Opladen - Kationen (positief geladen moleculen) bewegen naar de kathode (negatieve elektrode) terwijl anionen (negatief geladen moleculen) naar de anode bewegen (positieve elektrode).
2. Viscositeit - De viscositeit van het medium is tegengesteld aan de beweging van moleculen en het is constant voor een bepaald scheidingsmedium.
3. Radius van ion / molecuul - Elektroforetische mobiliteit neemt af met toenemende straal van het molecuul.

Daarom, als twee moleculen met dezelfde grootte worden onderworpen aan elektroforese, zal het molecuul met de grootste lading sneller bewegen. De migratiesnelheid van de geladen soort neemt toe met de toenemende sterkte van het elektrische veld. Het mechanisme van capillaire elektroforese is weergegeven in Figuur 2.

Figuur 2: Capillaire elektroforese

Electroosmotic Flow (EOF)

De elektro-osmotische stroming genereert de mobiele fase van capillaire elektroforese. In de meeste gevallen is het capillaire materiaal silica. Silica wordt gehydrolyseerd, waardoor negatief geladen SiO wordt verkregen^- ionen wanneer de oplossingen met een pH groter dan 3 door de capillaire buis worden geleid. Vervolgens draagt ​​de capillaire wand een negatief geladen laag. Kationen van de oplossing worden aangetrokken door deze negatieve ladingen, waardoor een dubbele laag van kationen op de negatieve ladingen wordt gevormd. De binnenste kationlaag is stabiel terwijl de buitenste kationlaag naar de kathode beweegt als een massastroom van geladen moleculen. De bulkstroom van kationen vindt plaats nabij de capillaire wand gedurende capillaire elektroforese. Elektro-osmotische stroming nabij de capillaire wand is getoond in figuur 3.

Figuur 3: Electro-osmotische stroom

De kleine diameter van de capillaire wand draagt ​​bij aan het maximaliseren van het effect van EOF, waardoor het een vitale rol speelt in de beweging van geladen soorten in capillaire elektroforese. 

Conclusie

Capillaire elektroforese is een analytische scheidingsmethode waarbij de geladen soorten worden gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit. In het algemeen dienen de grootte en de lading van de moleculen als factoren voor de scheiding.

Referentie:

1. "Capillaire elektroforese." Chemie LibreTexts, Libretexts, 28 nov. 2017, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Capillaire electroforese" door Apblum - (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Capillaire elektroforese" door Andreas Dahlin (CC BY 2.0) via Flickr
3. "Capillarywall" door Apblum - english wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia