Hoe kunnen fluorescente markers helpen bij het bepalen van een nucleotide-volgorde

DNA-sequencing is een techniek die helpt om de nucleotidesequentie van een bepaald DNA-molecuul te bepalen. De twee sequentiemethoden zijn Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie. Beide soorten sequentiemethoden zijn volledig geautomatiseerd bijgewerkt. Elke DNA-streng bestaat uit de vier nucleotiden: adenine (A), guanine (G), cytosine (C) en thymine (T). De nucleotiden in het DNA-fragment zijn gelabeld met vier afzonderlijke, fluorescente markers in beide typen sequentiemethoden. De fluorescerende merkers of fluoroforen zijn moleculen die in staat zijn licht te absorberen en uit te zenden met een goed gedefinieerde golflengte. De fluorescente markers worden door PCR in de DNA-streng opgenomen. Vervolgens wordt de sequentie van de nucleotiden bepaald door geautomatiseerde technieken.

Key Areas Covered

1. Wat is Sequencing
     - Definitie, Sanger-sequencing, Next-Generation-reeksen
2. Hoe kunnen fluorescente markers helpen bij het bepalen van een nucleotide-volgorde
     - Reeksen procedure

Sleutelbegrippen: Dideoxynucleotiden (ddNTP's), Fluorescentie Marker, Gelelektroforese, Next-Generation Sequencing, Nucleotide Sequence, PCR, Sanger Sequencing

Wat is Sequencing

Sequentiebepaling is een laboratoriumtechniek die wordt gebruikt om de nucleotidesequentie van een DNA-molecuul te bepalen. Twee hoofdtypen DNA-sequentiemethoden kunnen worden geïdentificeerd als Sanger-sequencing en sequentiëring van de volgende generatie. Zowel Sanger-sequencing als sequentiëring van de volgende generatie gebruiken gelabelde nucleotiden met fluorescentie voor de bepaling van de nucleotidensequentie.

Sanger-sequencing

Sanger-sequencing is de eerste ontwikkelde methode voor DNA-sequencing. De methode van sequensen werd voor het eerst ontwikkeld door Fredric Sanger in 1975. Het is daarom bekend als Sanger-sequencing. De methode van Sanger-sequencing is ook bekend als ketenbeëindigingsmethode omdat het betrokken is bij de selectieve opname van keten-terminerende dideoxynucleotiden (ddNTPS) door DNA-polymerase tijdens in vitro DNA-synthese. De verlenging van de DNA-streng wordt bereikt door de reguliere deoxynucleotiden (dNTP's). DdNTP's worden echter aan het reactiemengsel toegevoegd om de ketengroei te beëindigen. Deze ddNTP's zijn fluorescerend gemarkeerd. De vier typen ddNTP's worden toegevoegd aan vier afzonderlijke PCR-mengsels. Daarom worden vier afzonderlijke PCR-reacties uitgevoerd door toevoeging van ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP. In elk reactiemengsel wordt de ketengroei beëindigd bij elke respectievelijk A, G, C en T nucleotiden. Als een voorbeeld wordt in het reactiemengsel met toegevoegd ddATP de groei van verschillende amplicons beëindigd bij elk A-nucleotide in het DNA-fragment. Vervolgens worden deze vier reacties gescheiden door gelelektroforese en wordt een fluorometer gebruikt om te scannen naar de afzonderlijke fluorescentie. Sanger-sequencing wordt algemeen gebruikt voor het bepalen van de sequentie van de fragmenten die worden gebruikt bij DNA-klonering en de fragmenten geamplificeerd met PCR. De bepaalde nucleotide-sequenties worden getoond in Figuur 1.

Figuur 1: DNA-sequenties

Volgende generatie sequencing

De meest recente technieken voor het bepalen van DNA-sequenties zijn gezamenlijk bekend als sequencing van de volgende generatie. De sequentiëringsreacties worden in een keer op microschaal op een chip uitgevoerd. Daarom worden verschillende sequencingreacties parallel uitgevoerd. Bij next-generation sequencing wordt capillaire elektroforese gebruikt naast gelelektroforese voor de scheiding van amylons met verschillende lengten gecreëerd door ketenbeëindigingsmethode. Capillaire elektroforese is een analytische scheidingsmethode waarmee moleculen worden gescheiden op basis van hun elektroforetische mobiliteit.

Hoe kunnen fluorescentiemachines helpen bij het bepalen van een nucleotide-volgorde

Tijdens sequentiebepaling dient het DNA waarvan de sequentie moet worden bepaald als de matrijsstreng voor DNA-synthese door PCR. Een DNA-primer wordt gebruikt voor de initiatie van DNA-synthese door DNA-polymerase. Een mengsel van regulier, vier basen (dNTP's; dATP, dGTP, dCTP, dTTP) en een laag niveau van één van de vier dideoxynucleotiden (ddNTP's; ddATP, ddGTP, ddCTP en ddTTP) worden toegevoegd als componenten van de PCR-reactie. Vandaar dat vier individuele PCR-reacties worden uitgevoerd door de toevoeging van elk van de vier ddNTP's. Dideoxynucleotiden bezitten twee speciale kenmerken:

1. Ze missen een 3'-OH-groep waaraan het binnenkomende nucleotide wordt toegevoegd door DNA-polymerase. Vandaar dat de incorporatie van de ddNTP de ketengroei beëindigt.
2. Ze zijn gelabeld met verschillende fluorescerende kleurstoffen: de ddATP is gelabeld met een groene kleurstof, de ddGTP is gelabeld met een gele kleurstof, de ddCTP is gelabeld met blauw, en de ddTTP is gelabeld met rode kleurstof.

De ketenafsluitende ddNTP's worden echter in lage concentraties toegevoegd; ze beëindigen niet het hele PCR-proces tegelijk. Maar wanneer een van de vier ddNTP's wordt opgenomen in de groeiende keten, wordt die specifieke ketengroei beëindigd. daarom, aan het einde van elke vier PCR-reacties wordt een reeks amplicons (de resulterende DNA-fragmenten door PCR) geproduceerd, die worden beëindigd bij elk nucleotide van het doelwit-DNA-fragment. Deze amplicons kunnen in een gel worden gebruikt. De fluorescerende kleurstoffen die op een bepaald punt van de elektroforetische gel passeren, kunnen worden gescand met behulp van een fluorometer om de nucleotidensequentie in de geautomatiseerde DNA-sequencers te bepalen. De fluorescent-gelabelde nucleotide-sequentie verkregen in DNA-sequencing wordt getoond in Figuur 2.

Figuur 2: Fluorescerend gelabelde nucleotidesequentie

Door elk van de nucleotiden in de reeks te combineren, kan de nucleotidesequentie van het initiële DNA-fragment worden bepaald. De nucleotidesequentie van een fragment met 750-1.000 basenparen kan gemakkelijk worden bepaald per run door Sanger-sequencing. De sequentiebepaling van een volledig genoom blijft echter nog steeds voor de hand liggende vanwege de aanwezigheid van een groot aantal nucleotiden. 454-sequencing is een type sequencing van de volgende generatie waarmee 20 miljoen basenparen per enkele run kunnen worden gelezen.

Conclusie

Sequentiebepaling is een techniek die wordt gebruikt bij de bepaling van de nucleotidesequentie van een bepaald DNA-fragment. Sanger-sequencing en next-generation sequencing zijn de twee belangrijkste sequencing-technologieën. Beide technologieën gebruiken fluorescente markers voor de bepaling van de nucleotidesequentie. Elk van de vier keten-terminerende dideoxynucleotiden is gelabeld met vier verschillende fluorescerende kleurstoffen en ze worden gebruikt in vier afzonderlijke PCR-reacties om de sequentie te verkrijgen.

Referentie:

1. Adams, Jill U. "DNA Sequencing Technologies." Nature News, Nature Publishing Group, hier beschikbaar.
2. Carr, Steven M. Fluorescerende sequencing, hier beschikbaar.
3. "DNA-sequencing - Geautomatiseerde reeksen met fluorescerende kleurstoffen." JRank-artikelen, hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "Alineando secuencias (2)" door Shaury Nash (CC BY-SA 2.0) via Flickr
2. "Radioactive Fluorescent Seq" By Abizar op Engels Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia