Hoe worden restrictie-enzymen gebruikt om recombinant DNA te maken

Recombinant DNA is een kunstmatig type DNA dat wordt geproduceerd door DNA van twee of meer soorten te combineren. Het proces van het maken van recombinant DNA is bekend als moleculair klonen. De basisprocedure van moleculaire klonering omvat het isoleren van DNA, het knippen van DNA, het verbinden van DNA en het amplificeren van het recombinante DNA. Het gen van belang wordt ingevoegd in de vector, die dient als het dragermolecuul voor het gen van belang. De vector, samen met het gen van interesse, wordt naar het recombinante DNA verwezen. De belangrijkste rol van restrictie-enzymen bij genklonen is het knippen van DNA. Het belangrijkste kenmerk van restrictie-enzymen waardoor ze geschikt zijn voor DNA-manipulatie, is dat ze DNA knippen op specifieke doelen. Dit maakt de productie van gewenste DNA-fragmenten voor het verbindende doel mogelijk.

Key Areas Covered

1. Wat zijn restrictie-enzymen
     - Definitie, eigenschappen, rol
2. Hoe worden restrictie-enzymen gebruikt om recombinant DNA te maken
     - Gene Cloning, gebruik van restrictie-enzymen bij het klonen van genen

Sleutelbegrippen: knippen van DNA, Gene Cloning, Gene of Interest, Molecular Cloning, Recombinant DNA Technology, Restriction Enzymes, Vector

Wat zijn restrictie-enzymen

Een restrictie-enzym is een endonuclease dat korte, specifieke DNA-sequenties herkent die bekend staan ​​als restrictieplaatsen en het DNA op die plaats splitsen. Ze zijn een soort biochemische schaar die wordt geproduceerd door bacteriën. Restrictie-enzymen verdedigen bacteriën tegen bacteriofagen. Deze enzymen worden geïsoleerd uit bacteriën en worden gebruikt om DNA in het laboratorium te knippen. De werking van een restrictie-enzym is weergegeven in Figuur 1.

Figuur 1: Actie van HindIII

Het vermogen van restrictie-enzymen om DNA op precieze locaties te knippen, stelt onderzoekers in staat genbevattende fragmenten uit genomisch DNA te isoleren. Deze fragmenten kunnen in vectoren worden geïnsereerd om recombinante DNA-moleculen te produceren.  

Hoe worden restrictie-enzymen gebruikt om recombinant DNA te maken

Recombinant DNA is een DNA-molecuul dat is samengesteld uit DNA van twee of meer soorten. Het omvat hoofdzakelijk een gen van belang van een donorsoort en een vector die het gen van belang naar de gastheercel draagt. De belangrijkste stappen van de productie van recombinante DNA-moleculen zijn DNA-isolatie, digestie met restrictie-enzymen, ligatie van het gen van belang voor de vector en amplificatie van recombinant DNA-molecuul in een gastheercel. Het hele proces staat bekend als moleculair klonen. Moleculair klonen wordt getoond in Figuur 2.

Figuur 2: Moleculair klonen

Het gen van belang wordt eerst geïsoleerd uit biologische monsters in de vorm van genomisch DNA, of het kan door PCR worden geamplificeerd. Soms kan het gen van belang aanwezig zijn in een vector. Om te worden ingevoegd in de vector die geschikt is om het gen van belang in de gastheercel te dragen, moet het worden afgesneden van het moedermolecuul. Omdat restrictie-enzymen precies DNA knippen door restrictieplaatsen te herkennen, kunnen ze voor dit doel worden gebruikt. Het gen van belang en de vector kunnen worden gedigereerd met hetzelfde restrictie-enzym, of elk uiteinde van het gen van belang kan worden verteerd door twee restrictie-enzymen. Deze digestie produceert compatibele uiteinden voor de ligatie van het gen dat van belang is voor de vector. De digestie met twee restrictie-enzymen maakt de ligatie van fragmenten in de gewenste oriëntatie mogelijk. Na ligatie worden de resulterende recombinante DNA-moleculen getransformeerd in bacteriën om een ​​groot aantal kopieën te produceren.

Conclusie

Restrictie-enzymen zijn endonucleasen die DNA knippen op specifieke locaties die restrictieplaatsen worden genoemd. De eigenschappen van restrictie-enzymen kunnen worden gebruikt voor het produceren van recombinante DNA-moleculen door DNA op precieze locaties te knippen. Recombinant DNA bevat in het algemeen een interessant gen ingevoegd in een vector.

Referentie:

1. "Definitie van restrictie-enzym." MedicineNet, hier beschikbaar.
2. Griffiths, Anthony JF. "Making recombinant DNA." Een inleiding tot genetische analyse. 7e editie., U.S. National Library of Medicine, 1 januari 1970, Hier beschikbaar.

Afbeelding met dank aan:

1. "HindIII Restriction-site en plakkerige uiteinden vector" door Helixitta - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
2. "Construct" door Joyxi - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia