Verschil tussen DNA- en RNA-extractie
Share
De grootste verschil tussen DNA- en RNA-extractie is dat de pH-waarde van DNA-extractie is pH 8, terwijl de pH-waarde van RNA-extractie pH 4,7 is. DNA neigt te denatureren en gaat naar de organische fase bij zure pH. Bij alkalische pH ondergaat het RNA alkalische hydrolyse vanwege de aanwezigheid van 2'-OH in de ribosesuiker.
DNA- en RNA-extractie zijn de twee procedures die betrokken zijn bij de isolatie en zuivering van nucleïnezuren uit de cellen van weefsels. Beide procedures bestaan uit drie stappen. Goede kwaliteit DNA en RNA spelen een cruciale rol in moleculaire biologie, biotechnologie, genomica en epidemiologische experimenten.
Key Areas Covered
1. Wat is DNA-extractie
- Definitie, procedure
2. Wat is RNA-extractie
- Definitie, procedure
3. Wat zijn de overeenkomsten tussen DNA- en RNA-extractie
- Overzicht van gemeenschappelijke functies
4. Wat is het verschil tussen DNA- en RNA-extractie
- Vergelijking van belangrijke verschillen
Sleutelbegrippen: Cell Lysis, Denaturatie van Eiwitten, DNA-extractie, pH, Precipitatie, RNA-extractie
Wat is DNA-extractie
DNA-extractie is de isolatie- en zuiveringsprocedure van DNA. DNA kan worden geïsoleerd uit bloed, ingevroren weefselmonsters of blokken van paraffineweefsel. De drie stappen van DNA-extractie zijn cellysis, isolatie van DNA en precipitatie. Tijdens cellysis breken celmembraanscheidingen zoals celmembraan en de membranen van de kern open om DNA bloot te leggen. De volgende stap is het verwijderen van membraanlipiden uit het monster. Tenslotte omvat de precipitatie van DNA de verwijdering van DNA-geassocieerde eiwitten door protease en de verwijdering van RNA door RNase.
Figuur 1: DNA-extractieprocedure
Basisprotocollen van DNA-extractie
Hieronder worden de basisprotocollen van DNA-extractie weergegeven.
1. Cellysis met de cellysisbuffer om celmembranen te lyseren
2. Lipiden worden afgebroken met detergenten en oppervlakteactieve stoffen
3. Digestie van eiwitten door protease toe te voegen
4. Digestie van RNA door RNase toe te voegen
5. Scheiding van celresten, gedigereerde eiwitten, lipiden en RNA door het toevoegen van geconcentreerd zout gevolgd door centrifugatie
6. Ethanolprecipitatie van DNA met ijskoude ethanol of isopropanol. De ionsterkte van natriumacetaat kan worden gebruikt om de precipitatie te verbeteren. Het geprecipiteerde DNA verschijnt als draden in de uiteindelijke oplossing.
Figuur 2: geëxtraheerd DNA
Fenol-chloroform-extractie kan ook worden gebruikt om DNA van eiwitten te scheiden. Fenol denateert hier de eiwitten in het monster en het DNA blijft aan het einde van de extractie in de waterfase. En, in de organische fase, kun je de gedenatureerde eiwitten vinden. Een andere methode om DNA te extraheren is de minicolumnzuivering. Hier hangt de binding van DNA aan de kolom af van de pH en de zoutconcentratie van de buffer.
Wat is RNA-extractie
RNA-extractie verwijst naar het proces voor het zuiveren van RNA uit monsters. De conventionele methode voor RNA-extractie wordt de guanidinium thiocyanaat-fenol-chloroform extractie. Guanidiniumthiocyanaat denatureert eiwitten. Bovendien verstoort het de waterstofbinding van watermoleculen en dient het als het chaotrope middel. Een speciaal reagens wordt gebruikt in de RNA-extractie genaamd de Tri-reagens. Het bevat guanidiniumthiocyanaat, fenol en natriumacetaat. Het doel van de basisstappen van RNA-extractie is vergelijkbaar met die van DNA-extractie. Het protocol voor RNA-extractie wordt hieronder beschreven.
1. Cellen worden gewassen met ijskoude PBS om de osmolariteit van cellen te handhaven.
2. Zuig de cellen af en homogeniseer het monster met Tri-reagens.
3. Voeg chloroform toe en schud.
4. Centrifugatie kan in drie lagen resulteren. De bovenste laag is de waterige laag, die helder is. De middelste laag of de interfase bevat het geprecipiteerde DNA. De onderste laag is de organische laag, die roze is.
5. Verwijder de waterige laag en voeg isopropanol toe. Centrifugatie kan resulteren in een pellet.
6. Was de pellet met 75% ethanol. Droog de pellet aan de lucht.
7. Los de pellet op met TE-buffer of water.
Figuur 3: Fenol-chloroform-extractie van RNA
RNA-extractie wordt in het algemeen uitgevoerd bij een pH lager dan 7. Bij alkalische pH is RNA meer geneigd om te worden afgebroken door alkalische hydrolyse vanwege de aanwezigheid van een OH-groep op de 2'-positie van de ribosesuiker. Bovendien neigt RNA in de waterige fase te blijven bij een zure pH. Aan de andere kant heeft DNA de neiging om te denatureren en naar de organische fase te gaan bij een zure pH. Daarom kan DNA-extractie worden uitgevoerd bij ongeveer pH 8. DNA bestaat uit deoxyribosesuiker en ondergaat geen alkalische hydrolyse.
Overeenkomsten tussen DNA- en RNA-extractie
- DNA- en RNA-extractie zijn de procedures die betrokken zijn bij de isolatie en zuivering van nucleïnezuren uit biologische monsters.
- Beide procedures omvatten cellysis, zuivering van nucleïnezuren uit het puin en geassocieerde eiwitten en bereiding van de extracten.
- Voor beide procedures moet je overal koude omstandigheden handhaven.
- Betreft centrifugatie bij het scheiden van componenten in het mengsel.
- Noodzaak om de activiteit van nuclease-enzymen tijdens beide procedures te inactiveren.
- Fenol-chloroform-extractie is een van de kritische stappen van beide soorten extracties.
- Guanidiniumthiocyanaat kan worden gebruikt om nucleïnezuren te beschermen.
- Neerslag van RNA kan worden uitgevoerd met isopropanol.
- De ionsterkte van het natriumacetaat wordt gebruikt om de precipitatie van nucleïnezuren te verbeteren.
- De monsters kunnen worden gekwantificeerd door de OD bij 260 nm te meten.
Verschil tussen DNA- en RNA-extractie
Definitie
DNA-extractie: Isolatie en zuiveringsprocedure van DNA
RNA-extractie: Werkwijze voor het zuiveren van RNA uit monsters
Type nucleïnezuur geëxtraheerd
DNA-extractie: DNA
RNA-extractie: RNA
pH
DNA-extractie: Gedaan te 8
RNA-extractie: Gedaan te 4.7
Stappen
DNA-extractie: De celmembranen of cellysis doorbreken, de membraanlipiden verwijderen en het DNA precipiteren
RNA-extractie: Cellysis, guanidiniumthiocyanaat-fenol-chloroform-extractie, bereiding met isopropanol
Gebruik van DEPC-behandeld water
DNA-extractie: Geen
RNA-extractie: Alle reagentia worden bereid met DEPC-behandeld water
opslagruimte
DNA-extractie: DNA kan vooraf worden geëxtraheerd en wordt batchgewijs opgeslagen
RNA-extractie: RNA-extractie gebeurt net voor de downstream-procedures
Lange termijn opslag
DNA-extractie: Bij -20 ° C
RNA-extractie: Bij -80 ° C
Conclusie
DNA-extractie wordt uitgevoerd bij pH 8. DNA heeft de neiging om naar de organische fase te gaan als deze denatureert bij zure pH. Maar RNA-extractie wordt uitgevoerd bij lage pH om degradatie door alkalische hydrolyse te voorkomen. Het basisdoel van de stappen van zowel DNA- als RNA-extractie is vergelijkbaar. Het belangrijkste verschil tussen DNA- en RNA-extractie is de pH-omstandigheden die bij elk type extractie worden gebruikt.
Referentie:
1. "De basisprincipes van DNA-extractie." Alaska BioPREP virtueel leerboek, Alaska BioPREP Universiteit van Alaska Fairbanks, hier beschikbaar
2. "RNA-isolatie en reverse-transcriptieprotocol: cellen in cultuur." Abcam, hier beschikbaar
Afbeelding met dank aan:
1. "Figuur 17 01 02" door CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2. "DNA Extraction" door Joo Nath - Eigen werk (CC BY-SA 4.0) via Commons Wikimedia
3. "PhOH-CHCl3-extractie" door Squidonius (talk) - Eigen werk (Oorspronkelijke tekst: selfmade) (Public Domain) via Commons Wikimedia
