Verschil tussen T4 en T7 DNA-ligase

Belangrijkste verschil - T4 versus T7 DNA Ligase
 

DNA-ligase is een belangrijk enzym dat wordt gebruikt in technieken voor moleculaire biologie. Het werkt als een moleculaire lijm om nucleotiden te verbinden door fosfodiesterbindingen tussen nucleotiden te vormen. De fosfodiësterbindingen worden gevormd tussen het 3'-hydroxyleinde van de suikergroep en de 5'-eindfosfaatgroep. DNA-ligase is van vitaal belang in het replicatieproces om zich aan te sluiten bij de Okazaki-fragmenten van de achterblijvende streng en tijdens DNA-herstelmechanismen en in vitro kloneringsexperimenten om het gewenste gen van interesse aan het vectorgenoom te koppelen. Er zijn momenteel twee belangrijke DNA-ligasen die door moleculair biologen worden gebruikt: T4- en T7-DNA-ligasen. T4 DNA-ligase is een van de eerste enzymen die geïsoleerd worden uit de T4-bacteriofaag. T7 DNA-ligase, dat een kleiner eiwit is, is een enzym dat is geïsoleerd uit T7-bacteriofaag. Dit is het belangrijkste verschil tussen T4- en T7-DNA-ligasen.

INHOUD

1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is de werking van DNA Ligase
3. Wat is T4 DNA Ligase
4. Wat is T7 DNA Ligase
4. Overeenkomsten tussen T4 en T7 DNA-ligase
5. Vergelijking zij aan zij - T4 versus T7 DNA-ligase in tabelvorm
6. Samenvatting

Wat is de werking van DNA Ligase?

DNA-ligatie vindt plaats in een driestapsreactie. De eerste stap is een nucleofiele aanval op de alfa-fosfor van ATP die een covalent enzym-adenylaat-tussenproduct genereert waarin AMP is gekoppeld aan de terminale zijketenstikstof van lysine. In de tweede stap vindt een nucleofiele aanval plaats op de fosfor van het enzym-adenylaat door het 5'-fosfaat-getermineerde DNA-substraat, waarbij lysine vrijkomt en DNA-adenylaat wordt gevormd. In de laatste stap wordt DNA-adenylaat aangevallen door 3'-OH van een andere DNA-streng, waarbij AMP wordt vrijgegeven en de polynucleotiden worden samengevoegd.

Wat is T4 DNA Ligase?

T4 Ligase was de eerste ligase die werd geïsoleerd en geïdentificeerd door Meselson, Weigle en Kellenberger en het was de eerste ooit geproduceerde commerciële ligase. T4 DNA-ligase is een ATP-afhankelijk enzym dat de vorming van fosfodiesterbindingen katalyseert. Het is een enkele polypeptideketen met 487 aminozuurresiduen en heeft een molecuulgewicht van ongeveer 77 kDa. De optimale pH voor zijn activiteit ligt in het bereik van 7,5 - 8.

Figuur 01: T4 DNA-ligase

T4 DNA-ligase, zoals de naam suggereert, is aanwezig in bacteriofaag T4 en werd geïsoleerd wanneer faag het enzym produceerde na infectie met -E coli. Het enzym ligeert dubbelstrengige DNA-duplexen met stompe uiteinden en de te binden fragmenten moeten zich dicht bij elkaar bevinden.

Wat is T7 DNA Ligase?

T7-ligase is 41 kDa-eiwit geproduceerd door T7 Bacteriophage en wordt geïsoleerd door infecteren E coli cellen. De belangrijkste functie van T7-ligase is het ligeren van DNA-duplexen door fosfodiësterbindingen en het verbinden van nabijgelegen fragmenten van DNA tijdens kloneringsexperimenten. De optimale pH voor T7 DNA-ligase ligt in het bereik van 7,0 - 7,2. T7-ligase is ATP-afhankelijk. T7 DNA-ligasen zijn ook in staat om DNA- en RNA-hybriden te hybridiseren, hetgeen aanleiding geeft tot abnormale conformaties tijdens transcriptie; dit fenomeen is echter nog steeds onderzocht door in vitro studies.

Wat zijn de overeenkomsten tussen T4 en T7 DNA Ligase?

• T4 en T7 DNA-ligase nemen deel aan een ligatiereactie door hybridisatie van DNA-duplexen door vorming van fosfodiesterbindingen tussen het 3'-OH-uiteinde en het 5'-fosfaatuiteinde van het DNA-fragment.
• Beide enzymen ligeren stompe uiteinden van DNA-duplexen die zich dicht bij elkaar bevinden.
• Beide enzymen zijn ATP-afhankelijk.
• Deze enzymen worden geïsoleerd door te infecteren E coli cellen met de specifieke bacteriofaag.
• Toepassingen van beide enzymen omvatten:
  • Moleculair klonen - om het gen van belang aan de vector te ligeren
  • DNA-reparatie - om dubbelstrengige niches te repareren
  • In vitro DNA-replicatie
  • Ligase kettingreactie

Wat is het verschil tussen T4 en T7 DNA Ligase?

T4 versus T7 DNA-ligase
T4 DNA Ligase type van DNA-ligase geïsoleerd uit de bacteriofaag T4 en is betrokken bij het ligeren van aangrenzende DNA-fragmenten via vorming van fosfodiesterbindingen.	T7 DNA Ligase type van DNA-ligase geïsoleerd uit de bacteriofaag T7 en is betrokken bij het ligeren van aangrenzende DNA-fragmenten via vorming van fosfodiesterbindingen.
Grootte van de proteïne
De grootte van T4 DNA-ligase is 77 kDa - groter in vergelijking met T7 DNA-ligase.	De grootte van T7 DNA-ligase is 41 kDa.
Optimale pH
pH-bereik dat T4-DNA-ligase werkt, is 7,5 - 8,0.	pH-bereik dat T7-DNA-ligase werkt, is 7,0 - 7,2.

Samenvatting - T4 versus T7 DNA Ligase

DNA-ligasen zijn een belangrijke klasse van enzymen die betrokken zijn bij moleculaire klonering om recombinante DNA-moleculen te produceren die het gen van belang bevatten. De ligatiereactie is een energie-gebruikende reactie en er zijn nieuwe onderzoeken aan de gang om de nauwkeurigheid te verbeteren door de beschikbare ligasen te moduleren. T4- en T7-DNA-ligasen zijn twee soorten belangrijke DNA-ligase-enzymen die worden gebruikt in moleculair-biologische technieken. T7 DNA-ligase is ook een resultaat van onderzoek dat was gebaseerd op het primaire ligase geïsoleerd uit T4-geïnfecteerd E coli. T7 is meer efficiëntie en nauwkeurigheid afgebeeld in het uitvoeren van zijn functie vanwege zijn kleinere formaat. Dit is het verschil tussen T4 en T7 ligase.

Download PDF-versie van T4 versus T7 DNA Ligase

U kunt de PDF-versie van dit artikel downloaden en gebruiken voor offline doeleinden, zoals per citaatnotitie. Download hier de PDF-versie. Verschil tussen T4 en T7 Ligase.

Referenties:

1. "DNA Ligase, T4." DNA Ligase, T4 - Worthington Enzyme Manual, Beschikbaar Hier. Betreden op 22 augustus 2017.
2. Doherty, Aidan J., et al. "Bacteriophage T7 DNA Ligase OVEREXPRESSIE, PURIFICATIE, KRISTALLISATIE EN KARAKTERISERING." Journal of Biological Chemistry, 10 May 1996, Beschikbaar Hier. Betreden op 22 augustus 2017.

Afbeelding met dank aan:

1. "Afbeelding 3. Spalk Aid Single Stranded mRNA-DNA T4 DNA Ligase Ligation." (CC BY 3.0) via Commons Wikimedia