Verschil tussen RT-PCR en QPCR

Belangrijkste verschil - RT-PCR versus QPCR
 

Polymerase-kettingreactie is een techniek die wordt gebruikt om een ​​specifiek DNA-gebied te amplificeren in vitro. Door de uitvinding van deze techniek door Kary Mullis in 1983, zijn wetenschappers in staat duizenden tot miljoenen kopieën van specifieke DNA-fragmenten te maken voor onderzoeksdoeleinden. Momenteel is het een gebruikelijke en routinematig uitgevoerde techniek geworden in klinische en onderzoekslaboratoria voor een breed scala aan toepassingen. Er zijn variaties op de traditionele PCR-techniek zoals RT PCR, geneste PCR, multiplex PCR, Q PCR, RT - QPCR, etc. RT PCR en Q PCR zijn twee belangrijke variaties van PCR. Het belangrijkste verschil tussen RT-PCR en Q-PCR is dat RT PCR wordt gebruikt om genexpressie te detecteren door creatie vancomplementair DNA (cDNA) transcripten van RNA terwijl Q PCR wordt gebruikt om de PCR-producten in realtime kwantitatief te meten met behulp van fluorescerende kleurstoffen.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is RT PCR
3. Wat is QPCR
4. Vergelijking zij aan zij - RT PCR vs QPCR
5. Samenvatting

Wat is RT PCR?

Reverse-transcriptiepolymerasekettingreactie (RT-PCR) is een variant van PCR die wordt gebruikt om RNA-expressie te detecteren. Het is een zeer belangrijke methode voor het detecteren van mRNA-expressie in weefsels. RT PCR wordt gebruikt wanneer het uitgangsmateriaal van het monster RNA is. Bij RT-PCR wordt het matrijs-mRNA eerst omgezet in complementair DNA. Deze stap wordt gekatalyseerd door het enzym reverse transcriptase en het proces is bekend als reverse transcriptie. Ten tweede wordt traditionele PCR gebruikt voor het nieuw gesynthetiseerde cDNA voor de amplificatie.

RT PCR is een zeer gevoelige techniek die een relatief kleine hoeveelheid RNA-monster vereist. RT-PCR wordt vaak gebruikt bij de diagnose en kwantificatie van RNA-soorten, met name RNA-virussen zoals het humaan immunodeficiëntievirus en het hepatitis C-virus..

Figuur 01: RT-PCR-techniek

Wat is QPCR?

Kwantitatieve PCR (QPCR) is een variant van PCR die wordt gebruikt om de PCR-producten kwantitatief te meten. Het wordt ook wel real-time polymerasekettingreactie genoemd omdat het de amplificatie van realtime meet met behulp van real-time PCR-machine. Het is een geschikte methode voor het bepalen van de hoeveelheid van een doelsequentie of gen die in een monster aanwezig is. Het interessante kenmerk van QPCR is dat het zowel amplificatie als ware kwantificering combineert tot een enkele stap. Daarom kan de behoefte aan gelelektroforese bij detectie worden geëlimineerd door QPCR-techniek. QPCR gebruikt fluorescente kleurstoffen om PCR-producten te labelen tijdens de PCR-reacties die uiteindelijk leiden tot directe kwantificatie. Wanneer de PCR-producten zich ophopen, worden de fluorescentiesignalen ook geaccumuleerd en wordt deze gemeten door de realtime-machine. QPCR kan worden gecombineerd met RT PCR. Het staat bekend als RT - QPCR of QRT - PCR en wordt beschouwd als een meest krachtige, gevoelige en kwantitatieve methode voor detectie van RNA-niveaus in de cellen of weefsels..

SYBR Green en Taqman zijn twee methoden die worden gebruikt om het amplificatieproces van de real-time PCR te detecteren of te bekijken. SYBR Green-methode wordt uitgevoerd met behulp van een fluorescerende kleurstof genaamd SYBR-groen en detecteert de amplificatie door de kleurstof te binden om dubbelstrengig DNA te produceren. Taqman wordt uitgevoerd met behulp van dual-labelde probes en detecteert de amplificatie door degradatie van de probe door Taq-polymerase en releases van de fluorofoor zoals getoond in figuur 02. Beide methoden volgen de voortgang van het amplificatieproces en rapporteren de hoeveelheid van het product in real time.

Real-time PCR heeft een breed scala aan toepassingen zoals genexpressie kwantificering, microRNA en niet-coderende RNA-analyse, SNP-genotypering, detectie van kopienummervarianten, detectie van zeldzame mutaties, detectie van genetisch gemodificeerde organismen, detectie van infectieuze agentia, enz..

Figuur 02: Kwantitatieve PCR-techniek

Wat is het verschil tussen RT PCR en QPCR?

RT PCR versus QPCR
RT PCR is een techniek die wordt gebruikt om genexpressie door amplificatie te detecteren.	QPCR is een techniek die DNA amplificeert en de PCR-producten in realtime kwantificeert.
Betrokkenheid van reverse transcriptase-enzymen
Enzym reverse transcriptase wordt gebruikt voor RT PCR.	Enzym reverse transcriptase wordt niet gebruikt voor QPCR.
Gebruik van fluorescent gelabelde moleculen
Fluorescent gelabelde kleurstoffen of probes worden niet gebruikt voor RT PCR.	Fluorescent gelabelde kleurstoffen of sondes worden gebruikt voor QPCR.
Kwantificering van PCR-product
Tenzij gekoppeld aan QPCR, kwantificeert RT PCR het PCR-product niet.	QPCR meet het PCR-product kwantitatief.
Start materiaal
Uitgangsmateriaal is mRNA.	Uitgangsmateriaal is DNA.
Synthese van cDNA
Complementair DNA wordt geproduceerd tijdens de RT-PCR.	Complementair DNA wordt niet geproduceerd tijdens QPCR.

Samenvatting - RT PCR versus QPCR

RT PCR en QPCR zijn twee versies van traditionele PCR. RT-PCR-techniek wordt uitgevoerd voor mRNA-monsters en deze wordt aangestuurd door reverse transcriptie en productie van cDNA. QPCR wordt gebruikt om PCR-producten te kwantificeren tijdens de real-time PCR-thermische cycli met behulp van fluorescente kleurstoffen of gelabelde probes. In QPCR wordt de hoeveelheid PCR-product weergegeven door de geëmitteerde fluorescentiesignalen van het monster. RT-PCR wordt in de volksmond als een amplificatieproces gebruikt, terwijl QPCR gewoonlijk als een kwantificatieproces wordt gebruikt. Dit is het verschil tussen RT PCR en QPCR.

Referenties:
1. Deepak, SA, KR Kottapalli, R. Rakwal, G. Oros, KS Rangappa, H. Iwahashi, Y. Masuo en GK Agrawal. "Realtime PCR: revolutie van detectie en expressieanalyse van genen." Huidige genomica. Bentham Science Publishers Ltd., juni 2007. Web. 3 april 2017
2. Zeka, Fjoralba, Katrien Vanderheyden, Els De Smet, Claude A. Cuvelier, Pieter Mestdagh en Jo Vandesompele. "Rechtlijnige en gevoelige op RT-qPCR gebaseerde genexpressieanalyse van FFPE-monsters." Nature News. Nature Publishing Group, 22 februari 2016. Web. 3 april 2017
3. Overbergh, L., A. Giulietti, D. Valckx, B. Decallonne, R. Bouillon en C. Mathieu. "Het gebruik van real-time reverse transcriptase PCR voor de kwantificatie van cytokine-genexpressie." Journal of Biomolecular Techniques: JBT. The Association of Biomolecular Resource Facilities, maart 2003. Web. 3 april 2017

Afbeelding met dank aan:
1. "Taqman" Per gebruiker: Braindamaged - Eigen werk van de oorspronkelijke uploader (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Reverse transcriptie polymerase kettingreactie" door Jpark623 - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia