Verschil tussen Northern Southern en Western Blotting

Belangrijkste verschil - Northern vs Southern versus Western Blotting
 

Detectie van specifieke sequenties van DNA, RNA en eiwitten is essentieel voor verschillende soorten studies in de moleculaire biologie. Gelelektroforese is een techniek die DNA, RNA en eiwitten volgens hun grootte scheidt. Uit de gelprofielen worden een specifieke DNA-sequentie, RNA-sequentie of eiwit gedetecteerd door de speciale technieken die blotting en hybridisatie met gemerkte probes worden genoemd. Er zijn drie verschillende typen blotmethoden, namelijk zuidelijk, noordelijk en westers. Het belangrijkste verschil tussen Northern Southern en Western Blotting ligt in het type molecuul dat het uit een monster detecteert. Southern blotting is een methode die een specifieke DNA-sequentie van een DNA-monster detecteert. Northern-blotting is een techniek die een specifieke RNA-sequentie van een RNA-monster detecteert. Western blotting is een methode die een specifiek eiwit uit een eiwitmonster detecteert.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Southern Blotting
3. Wat is Northern Blotting
4. Wat is Western Blotting
5. Side-by-side vergelijking - Northern vs Southern vs Western Blotting
6. Samenvatting

Wat is Southern Blotting?

Southern-blotting-techniek werd ontwikkeld door E.M. Southern in 1975 voor de identificatie van een specifieke DNA-sequentie van een DNA-monster. Dit is de eerste blottingtechniek geïntroduceerd in de moleculaire biologie. Het maakte de detectie mogelijk van specifieke genen uit het DNA, specifieke fragmenten uit DNA, enz. Er zijn verschillende stappen betrokken bij de Southern Blotting-techniek. Ze zijn als volgt.

1. DNA wordt uit het monster geïsoleerd en gedigereerd met restrictie-endonucleasen.
2. Gedigereerd monster wordt gescheiden door Agarose gelelektroforese.
3. DNA-fragmenten in de gel worden gedenatureerd tot enkele strengen door het gebruik van een alkalische oplossing.
4. Enkelstrengig DNA wordt overgebracht naar een nitrocellulose filtermembraan door capillaire overdracht.
5. Overgebracht DNA wordt permanent op het membraan gefixeerd.
6. Vast DNA op het membraan wordt gehybridiseerd met gelabelde probes.
7. Ongebonden DNA wordt door wassen van het membraan weggewassen.
8. Röntgenfilm wordt aan het membraan blootgesteld en er wordt een autoradiogram gemaakt.

Southern-blotting wordt toegepast voor verschillende aspecten van de moleculaire biologie. Het is nuttig bij RFLP-mapping, forensische studies, DNA-methylatie bij genexpressie, detectie van gemuteerde genen bij genetische aandoeningen, DNA-fingerprinting, enz..

Figuur 01: Southern Blotting-techniek

Wat is Northern Blotting?

Northern-blotting is een methode ontworpen om een ​​specifieke RNA-sequentie of mRNA-sequentie van een monster te detecteren om genexpressie te bestuderen. Deze techniek is ontwikkeld door Alwine, Kemp en Stark in 1979. Het verschilt van de sourthern- en western-blottingtechnieken als gevolg van verschillende stappen. Deze techniek wordt echter ook uitgevoerd via gelelektroforese, blotting en hybridisatie met specifieke gelabelde probes en detectie. Northern blotting-techniek wordt als volgt uitgevoerd.

1. RNA wordt uit het monster geëxtraheerd en door middel van gelelektroforese gescheiden.
2. RNA wordt overgebracht van de gel op een blotting membraan en gefixeerd.
3. Het membraan wordt behandeld met een gelabelde probe bereid uit cDNA of RNA (de probe is complementair aan een specifieke sequentie in het monster).
4. De probe wordt geïncubeerd met het membraan om te binden met een specifieke sequentie.
5. Ongebonden sondes worden afgewassen.
6. Gehybridiseerde fragmenten worden gedetecteerd door een autoradiogram.

Northern-blotting is een belangrijk hulpmiddel bij de detectie en kwantificatie van gehybridiseerd mRNA, het bestuderen van RNA-degradatie, evaluatie van de halfwaardetijd van RNA, detectie van RNA-splitsing, bestuderen van genexpressie, enz..

Figuur 02: Northern Blotting

Wat is Western Blotting?

Western blotting is een methode voor het detecteren van een specifiek eiwit uit een eiwitmengsel door het gebruik van gelabeld antilichaam. Daarom is western blot ook bekend als een immunoblot. Deze techniek is geïntroduceerd door Towbin et al in 1979 en het wordt nu routinematig uitgevoerd in de laboratoria voor eiwitanalyse. Stappen zijn als volgt.

1. Eiwitten worden uit het monster geëxtraheerd
2. Eiwitten worden gescheiden door hun groottes met polyacrylamidegelelektroforese
3. Gescheiden moleculen worden door middel van elektroporatie in een PVDF-membraan of nitrocellulosemembraan overgebracht
4. Het membraan is geblokkeerd voor niet-specifieke binding aan de antilichamen
5. Overgebrachte eiwitten worden gebonden met primair antilichaam (met enzym gemerkte antilichamen).
6. Het membraan wordt gewassen om niet-specifiek gebonden primaire antilichamen te verwijderen
7. Gebonden antilichamen worden gedetecteerd door het toevoegen van een substraat en het detecteren van het gevormde gekleurde precipitaat

Western-blotting is bruikbaar bij de detectie van anti-HIV-antilichamen in een humaan serummonster. Western blot kan ook worden gebruikt als een bevestigende test voor Hepatitis B-infectie en definitieve test voor gekkekoeienziekte.

Figuur 03: Western Blotting

Wat is het verschil tussen Northern Southern en Western Blotting?

Noord versus Zuid versus Western Blotting
Type molecuul gedetecteerd
Northern Blotting	Northern blotting detecteert een specifieke RNA-sequentie van een RNA-monster.
Southern Blotting	Southern-blotting detecteert een specifieke DNA-sequentie van een DNA-monster.
Western Blotting	Western blotting detecteert een specifiek eiwit uit een eiwitmonster.
Type gel
Northern Blotting	Hierbij wordt agarose / formaldehyde gel gebruikt.
Southern Blotting	Dit maakt gebruik van een Agarose-gel.
Western Blotting	Hierbij wordt polyacrylamidegel gebruikt.
Blotting-methode
Northern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Southern Blotting	Dit is een capillaire overdracht.
Western Blotting	Dit is een elektrische overdracht.
Gebruikte sondes
Northern Blotting	cDNA- of RNA-probes die radioactief of niet-radioactief zijn gelabeld.
Southern Blotting	DNA-sondes zijn radioactief of niet-radioactief gelabeld.
Western Blotting	Primaire antilichamen worden gebruikt als probes.
Detectiesysteem
Northern Blotting	Dit gebeurt met behulp van een autoradiograaf of detectie van licht- of kleurverandering.
Southern Blotting	Dit gebeurt met behulp van een autoradiogram, detectie van licht of kleurverandering.
Western Blotting	Dit gebeurt met de detectie van licht- of kleurverandering.

Samenvatting - Northern versus Southern versus Western Blotting

Blotting is een speciale techniek die is ontwikkeld voor de identificatie van specifiek DNA, RNA of eiwit uit de monsters. Er zijn drie afzonderlijke blotprocedures, namelijk Noord, Zuid en West, om een ​​specifiek type molecuul te detecteren. Northern-blotting-techniek is ontworpen om een ​​specifieke RNA-sequentie uit een mengsel van RNA te detecteren. Southern-blottechniek maakt de detectie van een specifieke DNA-sequentie uit een DNA-monster mogelijk en de Western Blotting-techniek wordt ontwikkeld om een ​​specifiek eiwit uit een eiwitmengsel te identificeren.

Referenties
1. Gibbons, Janay. "Western Blot: Protein Transfer Overview." North American Journal of Medical Sciences. Medknow Publications & Media Pvt Ltd, maart 2014. Web. 27 maart 2017
2. Brown, T. "Southern blotting." Huidige protocollen in immunologie. U.S. National Library of Medicine, mei 2001. Web. 27 maart 2017
3. Hij, Shan L. "Northern blot." Methoden in enzymologie. U.S. National Library of Medicine, 2013. Web. 27 maart 2017

Afbeelding met dank aan:
1. "Northern Blot Scheme" door RNA405 - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia
2. "Western blot 114A" door Amanthabagdon - Eigen werk (Public Domain) via Commons Wikimedia