Verschil tussen Sanger-sequensen en Pyrosequencing

Belangrijkste verschil - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
 

DNA-sequencing is erg belangrijk voor DNA-analyse, omdat kennis van de juiste nucleotidenrangschikking op een bepaald DNA-gebied veel belangrijke informatie over het DNA onthult. Er zijn verschillende DNA-sequentiemethoden. Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee verschillende DNA-sequentiemethoden die veel worden gebruikt in Molecular Biology. Het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing is dat Sanger-sequencing maakt gebruik van dideoxynucleotiden om de synthese van DNA te beëindigen om de nucleotidesequentie te lezen, terwijl pyrosequencing de pyrofosfaatafgifte detecteert door de nucleotiden op te nemen en de complementaire sequentie te synthetiseren om de precieze volgorde van de sequentie te lezen.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Sanger-sequencing
3. Wat is Pyrosequencing
4. Vergelijking zij aan zij - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
5. Samenvatting

Wat is Sanger-sequencing?

Sanger-sequencing is een DNA-sequentiemethode van de eerste generatie, ontwikkeld door Frederick Sanger en zijn hogescholen in 1977. Het is ook bekend als Chain Termination Sequencing of Dideoxy-reeksen omdat het gebaseerd is op ketenbeëindiging door dideoxynucleotiden (ddNTP's). Deze methode werd ruim 30 jaar lang gebruikt totdat de New Generation Sequencing (NGS) werd ontwikkeld. Sanger-sequencingtechniek maakte de ontdekking van de juiste nucleotidenvolgorde of de aanhechting van een bepaald DNA-fragment mogelijk. Het is gebaseerd op de selectieve opname van ddNTP's en beëindiging van de DNA-synthese tijdens de in vitro DNA-replicatie. De afwezigheid van 3'-OH-groepen om fosfodiësterbindingsvorming tussen aangrenzende nucleotiden voort te zetten, is een uniek kenmerk van ddNTP's. Vandaar dat, zodra de ddNTP is verbonden, de kettingverlenging ophoudt en eindigt vanaf dat punt. Er zijn vier ddNTP's - ddATP, ddCTP, ddGTP en ddTTP - gebruikt in Sanger-sequencing. Deze nucleotiden stoppen het DNA-replicatieproces wanneer ze worden opgenomen in de groeiende DNA-streng en leiden tot verschillende lengten van kort DNA. Capillaire gelelektroforese wordt gebruikt om deze korte DNA-strengen op hun grootte te rangschikken op een gel zoals weergegeven in afbeelding 01.

Figuur 1: Capillaire gelelektroforese van gesynthetiseerd kort DNA

Voor in vitro replicatie van DNA, zouden er maar weinig vereisten moeten zijn. Ze zijn DNA-polymerase-enzym, matrijs-DNA, oligonucleotide-primers en deoxynucleotiden (dNTP's). Bij Sanger-sequencing wordt DNA-replicatie uitgevoerd in vier afzonderlijke reageerbuizen samen met vier typen ddNTP's afzonderlijk. Deoxynucleotiden worden niet volledig vervangen door de respectieve ddNTP's. Een mengsel van het specifieke dNTP (bijvoorbeeld; dATP + ddATP) wordt in de buis opgenomen en gerepliceerd. Vier afzonderlijke buisproducten worden op een gel in vier afzonderlijke wells gelopen. Vervolgens kan de sequentie door het lezen van de gel worden geconstrueerd zoals weergegeven in afbeelding 02.

Figuur 02: Sanger-sequencing

Sanger-sequencing is een belangrijke techniek die op veel gebieden van de moleculaire biologie helpt. Het project voor het humane genoom werd met succes voltooid met behulp van op Sanger-sequentiëring gebaseerde methoden. Sanger-sequencing is ook nuttig bij doel DNA-sequencing, onderzoek naar kanker en genetische ziekten, analyse van genexpressie, identificatie van mensen, detectie van pathogenen, microbiële sequencing enz..

Er zijn verschillende nadelen van Sanger-sequencing:

• De lengte van het DNA waarvan de sequentie wordt bepaald, kan niet langer zijn dan 1000 basenparen
• Er kan slechts één streng tegelijk worden gesequenced.
• Het proces is tijdrovend en duur.

Daarom zijn er met de tijd nieuwe geavanceerde sequentietechnieken ontwikkeld om deze problemen op te lossen. Sanger-sequencing is echter nog steeds in gebruik vanwege de zeer nauwkeurige resultaten tot fragmenten van ongeveer 850 basenparen.

Wat is Pyrosequencing?

Pyrosequencing is een nieuwe DNA-sequentiebepalingstechniek gebaseerd op de "sequencing by synthesis". Deze techniek is afhankelijk van de detectie van pyrofosfaatafgifte na de nucleotide-opname. Het proces wordt gebruikt door vier verschillende enzymen: DNA-polymerse, ATP-sulfurylase, luciferase en apyrase en twee substraten adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine.

Het proces begint met de primerbinding met de enkelstrengs DNA-matrijs en DNA-polymerase begint de opname van nucleotiden die daarmee complementair zijn. Wanneer de nucleotiden samenkomen (nucleïnezuurpolymerisatie), geeft het pyrofosfaat vrij (twee aan elkaar gebonden fosfaatgroepen) groepen en energie. Bij elke nucleotide-toevoeging komt een equimolaire hoeveelheid pyrofosfaat vrij. Pyrofosfaat wordt omgezet in ATP door middel van ATP-sulfurylase in de aanwezigheid van substraat-APS. Het gegenereerde ATP stuurt de door luciferase gemedieerde omzetting van luciferine naar oxyluciferine, waarbij zichtbaar licht wordt geproduceerd in hoeveelheden die evenredig zijn met de hoeveelheid ATP's. Licht wordt gedetecteerd door een fotondetectie-apparaat of door een fotomultiplier en creëert een pyrogram. Apyrase degradeert ATP en niet-opgenomen dNTP's in het reactiemengsel. dNTP-optelling gebeurt één keer per keer. Omdat de toevoeging van nucleotide bekend is volgens de opname en detectie van licht, kan de sequentie van de template worden bepaald. Pyrogram wordt gebruikt voor het genereren van de nucleotidesequentie van het monster-DNA zoals getoond in Figuur 03.

Pyrosequentiebepaling is erg belangrijk bij analyse van enkelvoudige nucleotide polymorfismen en het bepalen van de sequentie van korte stukken DNA. De hoge nauwkeurigheid, flexibiliteit, eenvoudige automatisering en parallelle verwerking zijn de voordelen van pyrosequencing ten opzichte van Sanger-sequentietechnieken.

Figuur 03: Pyrosequencing

Wat is het verschil tussen Sanger-sequensen en Pyrosequencing?

Sanger-sequencing versus Pyrosequencing
Sanger-sequencing is een DNA-sequentiemethode op basis van de selectieve opname van ddNTP's door DNA-polymerase en ketenafbreking.	Pyrosequentiebepaling is een DNA-sequentiemethode op basis van de detectie van pyrofosfaatafgifte na de incorporatie van nucleotide.
Gebruik van ddNTP
ddNTP's worden gebruikt om de DNA-replicatie te beëindigen	ddNTP's worden niet gebruikt.
Enzymen betrokken
DNA-polymerase wordt gebruikt.	Vier enzymen worden gebruikt: DNA-polymerase, ATP-sulfurylase, Luciferase en Apyrase.
Gebruikte substraten
APS en Luciferin worden niet gebruikt.	Adenosine 5'-fosfosulfaat (APS) en luciferine worden gebruikt.
Maximale temperatuur
Dit is een langzaam proces.	Dit is een snel proces.

Samenvatting - Sanger-sequencing versus Pyrosequencing

Sanger-sequencing en Pyrosequencing zijn twee DNA-sequentiemethoden die worden gebruikt in de moleculaire biologie. Sanger-sequencing construeert achtereenvolgens de volgorde van de nucleotiden door de ketenverlenging te beëindigen, terwijl de pyrosequentiebepaling de precieze volgorde van de nucleotiden in sequentie construeert door incorporatie van nucleotiden en het detecteren van de afgifte van pyrofosfaten. Daarom is het belangrijkste verschil tussen Sanger-sequencing en Pyrosequencing dat Sanger-sequencing werkt op sequencing door ketenbeëindiging, terwijl pyrosequencing werkt op sequencing door synthese.

Referentie:
1. Fakruddin, Md en Abhijit Chowdhury. "Pyrosequencing-een alternatief voor traditionele Sanger-sequenties." American Journal of Biochemistry and Biotechnology. Wetenschapspublicaties, 02 maart 2012. Web. 28 feb. 2017.
2. "Sanger-sequencing." Sanger-sequencing - ScienceDirect-onderwerpen. N.p., n.d. Web. 28 feb. 2017

Afbeelding met dank aan:
1. "Didesoxy-Methode" door Christoph Goemans (modifiziert) - Dr. Norman Mauder, auf Basis einer Datei von Christoph Goemans (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
2. "Sanger-DNA-seq" door Enzo op de Poolse taal Wikipedia (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
3. "Pyrosequentiebepaling" door microbiologiebytes (CC BY-SA 2.0) via Flickr