Verschil tussen Microarray en RNA-sequencing

Belangrijkste verschil - Microarray versus RNA-sequencing
 

Transcriptoom vertegenwoordigt het volledige RNA-gehalte dat aanwezig is in een cel, waaronder mRNA, rRNA, tRNA, afgebroken RNA en niet-afgebroken RNA. Het profileren van transcriptoom is een belangrijk proces om de celinzichten te begrijpen. Er zijn verschillende geavanceerde methoden voor transcriptoome profilering. Microarray- en RNA-sequencing zijn twee soorten technologieën die zijn ontwikkeld om transcriptoom te analyseren. Het belangrijkste verschil tussen microarray en RNA-sequencing is dat microarray is gebaseerd op het hybridisatiepotentieel van vooraf ontworpen gelabelde probes met doel-cDNA-sequenties, terwijl RNA-sequentiebepaling is gebaseerd op de directe sequentiebepaling van cDNA-strengen met behulp van geavanceerde sequentietechnieken zoals NGS. Microarray wordt uitgevoerd met de voorkennis over de sequenties en RNA-sequencing wordt uitgevoerd zonder de voorkennis over sequenties.

INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Microarray
3. Wat is RNA-sequencing
4. Vergelijking zij aan zij - Microarray versus RNA-reeksen
5. Samenvatting

Wat is Microarray?

Microarray is een robuuste, betrouwbare en high-throughput-methode die wordt gebruikt voor transcriptoomprofilering door wetenschappers. Het is de meest populaire benadering voor transcriptieanalyse. Het is een goedkope methode, die afhankelijk is van de hybridisatieprobes.

De techniek begint met extractie van mRNA uit het monster en de constructie van cDNA-bibliotheek van totaal RNA. Vervolgens wordt het gemengd met fluorescent gelabelde, vooraf ontworpen probes op een vast oppervlak (spotmatrix). Complementaire sequenties hybridiseren met de gelabelde probes in de microarray. Vervolgens wordt microarray gewassen en gescreend en wordt het beeld gekwantificeerd. Verzamelde gegevens moeten worden geanalyseerd om de relatieve expressieprofielen te krijgen.

De intensiteit van de microarray-sondes wordt verondersteld evenredig te zijn aan de hoeveelheid transcripten in het monster. De nauwkeurigheid van de techniek hangt echter af van de ontworpen probes, eerdere kennis van de sequentie en de affiniteit van probes voor hybridisatie. Vandaar dat microarray-technologie beperkingen heeft. Microarray-techniek kan niet worden uitgevoerd met transcripten met lage abundantie. Het faalt om isovormen te differentiëren en genetische varianten te identificeren. Aangezien deze methode afhangt van hybridisatie van probes, treden sommige problemen met betrekking tot hybridisatie zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie enz. Op in microarray-techniek..

Figuur 01: Microarray

Wat is RNA-sequencing?

RNA shotgun sequencing (RNA seq) is een recent ontwikkelde methode voor volledige transcriptoomsequencing. Het is een snelle en hoge doorvoermethode voor transcriptoomprofilering. Het kwantificeert de expressie van genen en resulteert in een diepgaand onderzoek van het transcriptoom. RNA-seq is niet afhankelijk van vooraf ontworpen probes of eerdere kennis van de sequenties. Daarom heeft RNA seq-methode een hoge gevoeligheid en het vermogen om nieuwe genen en genetische varianten te detecteren.

RNA-sequencing-methode wordt uitgevoerd via verschillende stappen. Totaal RNA van de cel moet worden geïsoleerd en gefragmenteerd. Vervolgens moet met behulp van reverse transcriptase een cDNA-bibliotheek worden vervaardigd. Elke cDNA-streng moet worden geligeerd met adapters. Vervolgens moeten de geligeerde fragmenten worden geamplificeerd en gezuiverd. Als uiteindelijk een NGS-methode wordt gebruikt, moet de sequentiebepaling van het cDNA worden uitgevoerd.

Figuur 02: RNA-sequentiebepaling

Wat is het verschil tussen Microarray en RNA-sequencing?

Microarray versus RNA-sequencing
Microarray is een robuuste, betrouwbare methode met hoge doorvoer.	RNA-sequencing is een nauwkeurige en high-throughput-methode.
Kosten
Dit is een goedkope methode.	Dit is een dure methode.
Analyse van een groot aantal monsters
Dit vergemakkelijkt het gelijktijdig analyseren van een groot aantal monsters.	Dit vergemakkelijkt het analyseren van een groot aantal monsters.
Gegevensanalyse
Gegevensanalyse is complex.	Meer gegevens worden gegenereerd in deze methode; daarom is het proces complexer.
Voorafgaande kennis van sequenties
Deze methode is gebaseerd op hybridisatieprobes, dus voorafgaande kennis van sequenties is vereist.	Deze methode is niet afhankelijk van de kennis van de eerdere reeks.
Structurele variaties en nieuwe genen
Deze methode kan geen structurele variaties en nieuwe genen detecteren.	Deze methode kan structurele variaties detecteren, zoals genfusing, alternatieve splicing en nieuwe genen.
Gevoeligheid
Dit kan verschillen in expressie van isovormen niet detecteren, dus dit heeft een beperkte gevoeligheid.	Dit heeft een hoge gevoeligheid.
Resultaat
Dit kan alleen resulteren in relatieve expressieniveaus. Dit geeft geen absolute kwantificering van genexpressie.	Het geeft absolute en relatieve expressieniveaus.
Data heranalyse
Dit moet opnieuw worden uitgevoerd om te reanalysen.	Reeksengegevens kunnen opnieuw worden geanalyseerd.
Noodzaak van specifiek personeel en infrastructuur
Specifieke infrastructuur en personeel zijn niet vereist voor microarray.	Specifieke infrastructuur en personeel vereist door RNA-sequencing.
Technische problemen
Microarray-techniek heeft technische problemen, zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie, beperkte detectie van individuele sondes, enz.	RNA seq-techniek vermijdt technische problemen zoals kruishybridisatie, niet-specifieke hybridisatie, beperkte detectie van individuele sondes, enz..
biases
Dit is een vooringenomen methode, omdat deze afhankelijk is van hybridisatie.	Bias is laag in vergelijking met microarray.

Samenvatting - Microarray versus RNA-sequencing

Microarray- en RNA-sequentiemethoden zijn platforms met hoge verwerkingscapaciteit die zijn ontwikkeld voor transcriptoomprofilering. Beide methoden produceren resultaten die sterk gecorreleerd zijn aan genexpressieprofielen. RNA-sequencing heeft echter voordelen ten opzichte van microarray voor analyse van genexpressie. RNA-sequencing is een gevoeliger methode voor de detectie van transcripties met lage abundanties dan microarray. RNA-sequencing maakt ook de differentiatie tussen isovormen en identificatie van genvarianten mogelijk. Microarray is echter de gebruikelijke keuze van de meeste onderzoekers, aangezien RNA-sequencing een nieuwe en dure techniek is met gegevensopslaguitdagingen en complexe gegevensanalyse.

Referenties:
1.Wang, Zhong, Mark Gerstein en Michael Snyder. "RNA-Seq: een revolutionair hulpmiddel voor transcriptomics." Natuurrecensies. Genetica. U.S. National Library of Medicine, januari 2009. Web. 14 maart 2017
2.Rogler, Charles E., Tatjana Tchaikovskaya, Raquel Norel, Aldo Massimi, Christopher Plescia, Eugeny Rubashevsky, Paul Siebert en Leslie E. Rogler. "RNA-expressie-microarrays (REMs), een methode met hoge doorvoer om verschillen in genexpressie in diverse biologische monsters te meten." Nucleic Acids Research. Oxford University Press, 01 januari 2004. Web. 15 maart 2017
3.Zhao, Shanrong, Wai-Ping Fung-Leung, Anton Bittner, Karen Ngo en Xuejun Liu. "Vergelijking van RNA-Seq en Microarray in transcriptome profilering van geactiveerde T-cellen." PLOS ONE. Public Library of Science, januari 2014. Web. 15 maart 2017

Afbeelding met dank aan:
1. “Journal.pcbi.1004393.g002” Door Malachi Griffith, Jason R. Walker, Nicholas C. Spies, Benjamin J. Ainscough, Obi L. Griffith - (CC BY 2.5) via Commons Wikimedia
2. "Microarray" door Bill Branson (fotograaf) - Nationaal kankerinstituut (publiek domein) via Commons Wikimedia