Verschil tussen genklonering en PCR
Share
Belangrijkste verschil - Gene Cloning versus PCR
De synthese van vele kopieën van DNA uit een specifiek DNA-fragment wordt DNA-amplificatie genoemd. Er zijn twee belangrijke DNA-amplificatieprocessen, namelijk genklonen en PCR. Het belangrijkste verschil tussen genklonen en PCR is, genklonen produceert de meerdere kopieën van een specifiek gen in vivo door het construeren van een recombinant DNA en het groeien in een gastheerbacterie, terwijl PCR miljoenen kopieën van een specifiek DNA-fragment produceert in vitro ondergaan herhaalde cycli van denaturatie en synthese.
INHOUD
1. Overzicht en belangrijkste verschil
2. Wat is Gene Cloning
3. Wat is PCR
4. Vergelijking zij aan zij - Gene Cloning versus PCR
5. Samenvatting
Wat is Gene Cloning?
Gene-klonen is een techniek die wordt gebruikt om een specifiek gen uit het geëxtraheerde genomische DNA van een organisme te lokaliseren en te vermenigvuldigen door de constructie van recombinant DNA. Genomisch DNA bevat duizenden verschillende genen gecodeerd voor eiwitten. Wanneer DNA wordt geëxtraheerd, omvat het alle mogelijke genen die het kan verdragen. Gene-kloneringstechniek heeft de detectie van een specifiek gen uit het totale DNA mogelijk gemaakt. Daarom dient genklonen als een belangrijk hulpmiddel in de moleculaire biologie.
Het maken van een genomische bibliotheek van een organisme is essentieel bij genklonen als er geen aanwijzing is over de locatie van het relevante gen in het DNA. Een genomische bibliotheek wordt gemaakt met behulp van de volgende stappen.
Stap 1: Extractie van het totale DNA van een organisme dat het gewenste gen bevat.
Stap 2: Restrictiedigestie van het geëxtraheerde DNA om kleine hanteerbare fragmenten te produceren. Deze stap wordt vergemakkelijkt door restrictie-endonucleasen.
Stap 3: Selectie van een geschikte vector en opening van het vector-DNA met behulp van dezelfde restrictie-endonucleasen. Bacteriële plasmiden worden gewoonlijk gebruikt als vectoren om vreemd DNA te dragen. Plasmiden zijn kleine cirkels van DNA die zich in bacteriën bevinden.
Stap 4: Combinatie van het vector-DNA en gefragmenteerd DNA om een recombinant DNA-molecuul te produceren. Deze stap wordt bepaald door DNA-ligase.
Stap 5: Overdracht van recombinante DNA-moleculen in gastheerbacteriën. Deze stap staat bekend als transformatie en wordt uitgevoerd met behulp van een hitteschok.
Stap 5: Screening van getransformeerde bacteriële cellen op een kweekmedium. Een gemengde populatie van getransformeerde en niet-getransformeerde gastheercellen wordt aan het einde van het transformatieproces verkregen. Als gen van belang omvat alleen in getransformeerde gastheercellen. Daarom is het noodzakelijk om getransformeerde cellen te selecteren. De selectie is gemaakt met behulp van selectieve media die antibiotica bevatten. Alleen de getransformeerde cellen groeien op dit screeningmedium waardoor de selectie mogelijk wordt.
Stap 6: Teelt van bacteriën om een genbibliotheek te produceren. In deze stap worden de getransformeerde gastheercellen ingebracht in verse kweekmedia die optimale groei-eisen verschaffen. Totale kolonies op de kweekplaten vertegenwoordigen de genomische bibliotheek van dat organisme.
Stap 7: Het recombinante DNA-molecuul dat het gen van belang bevat, moet worden gescreend van duizenden gekloneerde fragmenten van recombinant DNA. Het kan worden bereikt door het gebruik van probes die het specifieke gen of de specifieke eiwitresultaten van dat gen markeren.
Zodra het geïnteresseerde gen dat de bacteriekolonie bevat, wordt geïdentificeerd uit de totale kolonies, is het mogelijk om miljoenen kopieën te maken van het recombinante plasmide dat het gen bevat..
Het klonen van genen wordt gebruikt bij het opzetten van genbibliotheken, het produceren van speciale eiwitten, vitaminen, antibiotica, hormonen, het bepalen van sequenties en het in kaart brengen van genomen van de organismen, waardoor meerdere kopieën van individuen DNA in de forensische geneeskunde enz. Worden gemaakt..
Figuur 1: Gene Cloning
Wat is PCR?
Polymerase Chain Reaction (PCR) is een techniek die een groot aantal kopieën van een bepaald DNA-fragment genereert. Exponentiële amplificatie van een specifieke DNA-sequentie wordt verkregen door PCR onder in vitro voorwaarden. Deze techniek is een zeer krachtig hulpmiddel in Molecular Biology omdat het een kleine hoeveelheid DNA kan vermenigvuldigen tot een bruikbare hoeveelheid. PCR werd geïntroduceerd door Kary Mullis in 1983 en deze prijswinnende uitvinding creëerde een enorme vooruitgang in Molecular Biology.
PCR-techniek volgt op herhaalde PCR-reacties zoals getoond in Figuur 02. Eén PCR-reactie bestaat uit drie hoofdstappen die optreden bij drie verschillende temperaturen; denaturatie van dubbelstrengs DNA op 94 0C, uitgloeien van primers op 68 0C en strengrek bij 72 0C. Daarom moet, wanneer PCR wordt uitgevoerd, temperatuurschommeling in hoge mate worden gehandhaafd voor juiste replicatie. PCR wordt uitgevoerd in een PCR-machine in PCR-buizen. PCR-buizen worden geladen met correcte PCR-mengsels die matrijs-DNA, Taq-polymerase, primers, dNTP's en buffer bevatten. Denaturatie van dubbelstrengig monster-DNA in enkelstrengig DNA wordt uitgevoerd door de waterstofbindingen tussen complementaire basen op 94 - 98 te verbreken 0C. Vervolgens worden enkele strengen van matrijs-DNA blootgesteld aan primers. Een paar primers (voorwaarts en achterwaarts) moet worden voorzien, en ze moeten thermostabiel zijn om hoge temperaturen te verdragen. Primers zijn enkelstrengs korte DNA-sequenties die complementair zijn aan uiteinden van het doel-DNA-fragment. Synthetische primers worden gebruikt in PCR. Primers binden met de complementaire basen van monster-DNA en initiëren de synthese van een nieuwe streng. Deze stap wordt gekatalyseerd door een enzym genaamd Taq-polymerase; een thermostabiel DNA-polymerase-enzym geïsoleerd uit Thermus auqaticus. Wanneer primers en nucleotiden (bouwstenen) beschikbaar zijn, construeert Taq-polymerase de nieuwe DNA-streng die complementair is aan matrijs-DNA. Aan het einde van het PCR-programma werd geamplificeerd DNA-fragment waargenomen met behulp van gelelektroforese. Als verdere analyse vereist is, wordt het PCR-product uit de gel gezuiverd.
PCR is zeer nuttig voor het diagnosticeren en monitoren van genetische en verworven ziekten, identificatie van criminelen (op het gebied van forensisch onderzoek), het bestuderen van de structuur en functie van een gericht segment van DNA, het bepalen van sequenties en het in kaart brengen van genomen van organismen, etc. PCR is geworden een routine laboratoriumtechniek in medische en moleculaire biologie onderzoekslaboratoria onder wetenschappers omdat het een breed scala aan toepassingen heeft.
Figuur 2: Polymerase kettingreactie
Wat is het verschil tussen Gene Cloning en PCR?
Gene Cloning versus PCR | |
| Gene-klonen is het proces van het maken van meerdere kopieën van een specifiek gen in vivo door recombinant DNA en transformeren in een gastheerbacterie. | De PCR-techniek produceert meerdere kopieën van een bepaalde DNA-sequentie in vitro door herhaalde cycli van PCR-reacties. |
| Vereiste voor het construeren van recombinant DNA | |
| Recombinant DNA wordt geproduceerd om het gen te lokaliseren. | Recombinant DNA wordt niet geproduceerd. |
| Noodzaak van arbeid | |
| Dit proces is arbeidsintensief. | Intensieve arbeid is niet nodig. |
| In vivo of in vitro proces | |
| Constructie van recombinant DNA is in vitro en de amplificatie van DNA is in vivo. | De versterking van DNA gebeurt volledig in vitro. |
Samenvatting - Gene Cloning versus PCR
Gene-klonen en PCR zijn twee werkwijzen die worden gebruikt voor DNA-amplificatie. PCR is een in vitro proces dat meerdere kopieën van DNA van een bepaald DNA-fragment maakt zonder gebruik te maken van recombinant DNA en een gastheerorganisme. Het klonen van genen is voornamelijk een in vivo proces dat resulteert in meerdere kopieën van een geïnteresseerde gen in het gastheerorganisme via constructie van recombinant DNA. Dit is het verschil tussen genklonen en PCR.
Referentie:
1. Griffiths, Anthony JF. "Klonen van een specifiek gen." Moderne genetische analyse. U.S. National Library of Medicine, 01 januari 1999. Web. 22 feb. 2017
2. "Polymerase-kettingreactie (PCR)." Nationaal centrum voor informatie over biotechnologie. Amerikaanse National Library of Medicine, n.d. Web. 22 feb. 2017
Afbeelding met dank aan:
1. "Figuur 17 01 06" Door CNX OpenStax - (CC BY 4.0) via Commons Wikimedia
2. "PCR" By Madprime - Eigen werk (CC BY-SA 3.0) via Commons Wikimedia
